Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
rejeneratif tıbbın temel bir amacı tamir veya hasarlı değiştirmek için kullanılabilecek yeni, fonksiyonel hücrelerin nesil, doku dejenere. başka bir hücre tipinden dönüştürerek, yeni olanları içine kolayca kullanılabilir yetişkin hücrelerinin yeniden şekillendiriyor, gerekli hücre popülasyonu erişimi bol ya da zor değil, özellikle bir özellikle çekici bir yaklaşımdır. Ancak, yetişkin hücreleri son derece stabildir. Onlar olgun terminali uzmanlık ulaştığında, bunlar stabil bunu 1 korumak onların seçeneklerinde kademeli kısıtlama yoluyla farklılaştırılmış devlet kazanmak ve.
Somatik hücre (iPS) bir pluripotency için yeniden programlama sağlayacak protokoller bir dizi geliştirilmiştir Son yıllarda, transkripsiyon bir dizi 2,3 faktörleri zorla sentezlenmesi yoluyla elde etti. Alternatif olarak, hücre dönüşüm 4 tek sokulması doğrudan nesilli transdiferansiasyon ile elde edilebilir </sup> ya da transkripsiyon bir arada 5-7 faktörleri. Bu strateji, bir de-farklılaştırılmış devlet aracılığıyla geçiş dahil ancak belirli transkripsiyon 8 faktörleri yüksek ifade gerektiriyor.
Son zamanlarda sitidin analog 5-azasitidin (5-aza-CR), iyi karakterize edilmiş DNA metiltransferaz inhibitörünün demetile özelliklerine yetişkin hücrelerinin Kısa süreli dayanan bir dönüşüm protokolü geliştirilmiştir. Demetilasyon adım hemen gerekli terminali fenotip elde etmek için izin veren bir özel farklılaşma protokolü 9-11 tarafından takip edilir. Bu yöntem, farklı soy hücreleri içine olgun farklılaşmış hücreleri dönüştürmek mümkün olup viral vektörlerin kullanımı ve bir egzojen transkripsiyon faktörleri transfeksiyon hem de önlemek için önemli bir avantaja sahiptir. istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma ve istikrarsızlık hücre ile ilgili artmış duyarlılık da önlenir.
<p class="Jove_content"> Burada sunulan tamamen işlevsel insülin salgılayan hücrelerin içine yetişkin insan deri fibroblast dönüşüm sağlayan detaylı bir protokol. Bununla birlikte, teknik, farklı hücre tipleri uygulanmış ve çeşitli farklılaşma yollarının doğru hücreleri ele alırken, olumlu sonuçlar üretti dikkati çekiyor. Ayrıca, epigenetik dönüşüm başarılı bir şekilde, insan, domuz cinsi 9-13 hem de köpek kullanılmıştır yaklaşım, geniş bir etkinlik ve dayanıklılık göstermektedir (Eser sunulmuştur).Protocol
Representative Results
Discussion
bu yazıda bir dokuya özgü indüksiyon protokolü takiben 5-aza-CR geçici ve kısa maruz kalma ile, insülin üreten hücreler, insan deri fibroblast dönüşümünü sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım transkripsiyon faktörleri veya microRNA zorla ifade ne de hücreler daha istikrarsız ve hatalar 14 eğilimli kılan istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma olmadan, mezodermden endoderm ilgili hücrelere bir anahtar verir.
İlk adımda, hücre plas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Carraresi Vakfı ve Diyabet Araştırmaları için Avrupa Vakfı (EFSD) tarafından finanse edildi. GP Milano Üniversitesi'nden bir post-doc bursu tarafından desteklenmektedir. Epigenetik ve Periconception çevre ve BM1308 Paylaşımı büyük hayvan modellerinde gelişmeler MALİYET Eylem (Salaam): Yazarlar MALİYET Eylem FA1201 EPICONCEPT üyeleridir. TALB'e MALİYET Eylem CM1406 epigenetik Kimyasal Biyoloji (EPICHEM) üyesidir.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained?. Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
