Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d'insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
Un objectif fondamental de la médecine régénérative est la génération de nouvelles cellules, fonctionnels qui peuvent être utilisés pour réparer ou remplacer endommagé, dégénéré tissus. Refaire cellules adultes facilement disponibles dans de nouveaux, en les convertissant d'un type de cellule à une autre, est une approche particulièrement attrayante, surtout lorsque la population de cellules requises ne sont pas abondants ou difficiles d'accès. Cependant, les cellules adultes sont remarquablement stables. Ils acquièrent leur état différencié à travers une restriction progressive de leurs options et, une fois qu'ils atteignent la spécialisation terminale mature, ils conservent de manière stable , il 1.
Dans les dernières années , un certain nombre de protocoles ont été développés, qui permettent la reprogrammation de la pluripotence d'une cellule somatique (iPS) obtenue par l'expression forcée d'un ensemble de facteurs de transcription 2,3. Alternativement, la conversion de cellules peut être obtenue par transdifférenciation lignée directe, l' introduction d' un seul 4 </sup> ou une combinaison de facteurs de transcription 5-7. Cette stratégie ne concerne pas le passage par un état de différenciée mais nécessite une forte expression de facteurs de transcription spécifiques 8.
Nous avons récemment développé un protocole de conversion basé sur la brève exposition des cellules adultes aux propriétés de déméthylation de la cytidine analogique 5-azacytidine (5-aza-CR), un inhibiteur de l'ADN méthyltransférase bien caractérisé. L'étape de déméthylation est immédiatement suivie par un protocole de différenciation spécifique 11/09 qui permet d'obtenir le phénotype de terminal requis. Ce procédé est capable de transformer des cellules matures différenciées en cellules d'une lignée différente et présente l'avantage considérable d'éviter à la fois l'utilisation de vecteurs viraux et la transfection de facteurs de transcription exogènes. L'acquisition d'un état pluripotent stable, et une sensibilité accrue liée à la cellule d'instabilité est également évitée.
<p class="Jove_content"> Le protocole détaillé qui permet la conversion des fibroblastes adultes de peau humaine en cellules sécrétrices d'insuline entièrement fonctionnel est présenté ici. Toutefois, il convient de noter que la technique a été appliquée à différents types de cellules et a donné des résultats positifs, lorsque les cellules d'adressage vers différentes voies de différenciation. En outre, la conversion épigénétique a été utilisé avec succès dans l'espèce humaine et porcine 9-13, ainsi que chez le chien (manuscrit soumis) , suggérant une grande efficacité et la robustesse de l'approche.Protocol
Representative Results
Discussion
La présente manuscrit décrit un procédé qui permet la conversion des fibroblastes de peau humaine dans des cellules productrices d'insuline, par une exposition transitoire et de courte durée à 5-aza-CR, suivi d'un protocole d'induction spécifique d'un tissu. Cette approche permet un passage du mésoderme aux cellules de l' endoderme liées, sans l'expression forcée de facteurs de transcription ou de microARN , ni l'acquisition d'un état pluripotent stable, qui rend les cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et la Fondation européenne pour l'étude du diabète (EFSD). GP est soutenu par une bourse post-doc de l'Université de Milan. Les auteurs sont membres de l'Action COST FA1201 Epiconcept: Epigénétique et périconceptionnelle environnement et l'action COST partage BM1308 avance sur les grands modèles animaux (SALAAM). TALB est membre du COST Action CM1406 épigénétique Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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