Cette procédure décrit comment encapsuler cytochrome c (cyt. C) en silice (SiO 2) sol-gels, processus ces gels pour former bioaerogels, et utiliser ces bioaerogels de reconnaître rapidement l' oxyde nitrique (NO) par une réaction en phase gazeuse. Ce type de protocole peut aider dans le développement futur de biocapteurs ou d'autres dispositifs bioanalytiques.
Des applications telles que les capteurs, les batteries et les piles à combustible ont été améliorées grâce à l'utilisation d'aérogels très poreux lorsque des composés fonctionnels sont encapsulés dans les aérogels. Cependant, peu de rapports sur l'encapsulation des protéines dans les sol-gels qui sont traités pour former des aérogels existent. Un procédé d'encapsulation de cytochrome c (cyt. C) dans la silice (SiO 2) sol-gels qui sont traitées dans des conditions surcritiques pour former bioaerogels avec une activité en phase gazeuse pour l' oxyde nitrique (NO) est présenté. Cyt. C est ajoutée à un mélange de sol de silice sous la concentration en protéine et le tampon contrôlée des conditions de force. Le mélange de sol est ensuite gélifiée et le liquide remplissant les pores du gel est remplacé par une série d'échange de solvant avec du dioxyde de carbone liquide. Le dioxyde de carbone est amené à son point critique et évacué hors de former des aérogels secs avec cyt. C encapsulé à l' intérieur. Ces bioaerogels sont caractérisés par la spectroscopie UV-visible d'uned dichroïsme circulaire et peut être utilisé pour détecter la présence d'oxyde nitrique en phase gazeuse. Le succès de ce procédé dépend de la régulation de la concentration cyt. C et la concentration du tampon et ne nécessite pas d' autres composants tels que des nanoparticules métalliques. Il peut être possible d'encapsuler d'autres protéines en utilisant une approche similaire rendant cette procédure importante pour l'avenir le potentiel de développement de l'appareil bioanalytique.
Cytochrome c (cyt. C) est une protéine de transfert d' électrons clé impliquée dans les réactions de la respiration cellulaire de l'organisme. Il a été montré être impliqué dans l' apoptose, une forme contrôlée de mort cellulaire, et il est capable de détecter de telles petites molécules toxiques comme l' oxyde nitrique et le monoxyde de carbone 1-3. l'oxyde nitrique (NO) joue un rôle dans divers processus physiologiques qui se produisent dans les systèmes nerveux, cardiovasculaire et immunitaire. Bien que cyt. C nécessite généralement un environnement aqueux tamponné à des valeurs de pH neutre à demeurer structurellement intact et actif, la recherche a montré que cyt. C peut conserver sa structure et sa fonction dans des matériaux solides appelés aérogels sous certaines conditions 4-9.
Aérogels sont des matériaux très poreux souvent formés par la synthèse d'oxydes métalliques de sol-gel (Bien que les aérogels d'oxydes métalliques sont très fréquentes, le carbone et d'autres types d'aérogels ont été synthétisés. Un exemple est InP aerogels) 10 et le séchage de ces sol-gels, de telle sorte que la matrice solide poreuse est laissée inchangée 11-14. Tous les pores aérogels solides donnent lieu à la surface disponible rendant beaucoup aérogels extrêmement utiles pour toutes les applications dans lesquelles les réactions de surface sont importantes. Quand le produit chimique ou la fonctionnalité biochimique est assemblé au sein de la nanoarchitecture aérogel, il a été montré que la porosité physique et une meilleure surface des aérogels aident à améliorer les capteurs, ainsi que des électrodes pour batteries, piles à combustible, et des applications supercondensateur 11,15-23 . Pour sécher les aérogels d'une manière qui laisse la matrice solide poreuse inchangée, il est typique pour éliminer le solvant restant dans les pores après la synthèse sol-gel, par extraction par solvant supercritique. Tout effondrement des pores qui peuvent être causés par les forces de tension de surface comme une évaporation du solvant du gel sont minimisés parce que dans le séchage supercritique, une interface liquide-vapeur jamais formes.
<p class="jove_content"> Il existe de nombreux rapports de protéines hème tels que cyt. c étant encapsulé dans sol-gels qui ont été conservés par voie humide ou qui ont été séchées ambiently 24-30. Les rapports des biomolécules encapsulant dans des sol-gels qui sont ensuite séchées dans des conditions surcritiques pour former aérogels sont rares en raison du traitement nécessaire qui peut être préjudiciable à la structure de nombreuses protéines. Dans le cas de cyt. C, certaines conditions permettent de conserver la capacité de cyt. C pour détecter et répondre à l' oxyde nitrique en phase gazeuse dans les aérogels. Une fois stabilisé à l'aérogel, la structure de l'aérogel poreux de haute qualité facilite la réaction entre cyt. C et 4,8,9 de l' oxyde nitrique. Cyt. C peut être encapsulé dans aérogels d'abord l' associer en couches multiples autour d' or ou d' argent des nanoparticules en solution 4-8. Ces superstructures à couches multiples servent à protéger la protéine dans la matrice d'aérogel. Dans le plus récent approach que nous avons mis au point, lorsque la concentration en protéine et le tampon de force sont contrôlés en même temps que d' autres conditions de synthèse, cyt. c conserve l' intégrité dans les aérogels même sans nanoparticule métallique 9 association initiale.La synthèse commence comme de nombreuses synthèses d'aérogel commencent par mélange des précurseurs de silice sol-gel pour une période de temps définie. Il est après un certain temps que cyt. C est ajouté comme une solution tamponnée dans le mélange de mélange. Il se produit alors une gélification pour former une structure solide de silice poreuse dont les pores sont remplis d'eau, le méthanol, les réactifs restants et les sous-produits. Ce liquide qui remplit les pores peut être rincé avec divers solvants à travers une série d'échanges de solvants, les derniers échanges avec le dioxyde de carbone liquide ayant lieu dans un appareil de séchage au point critique conservés à basse température. Amener les gels au-dessus de la température critique (31,1 ° C) du dioxyde de carbone facilite la formation en tant quefluide upercritical intérieur de l'appareil sous pression qui peut être évacué pour former des aérogels secs, très poreux. La température relativement basse requise pour le dioxyde de carbone pour former un fluide supercritique est avantageux par rapport à d'autres solvants, car elle conserve la protéine en dessous d'une température à laquelle il peut subir une dénaturation.
Notre approche sans nanoparticule métallique à encapsuler cyt. C dans aérogels est avantageuse car elle est une procédure simple qui peut conduire à l'élaboration d'un protocole plus généralement applicable pour l' encapsulation d' autres protéines ainsi. De nombreuses protéines ne peuvent pas interagir avec les nanoparticules métalliques de la même manière que cyt. C ne et la synthèse de nanoparticules métalliques ou de l' achat ajoute du temps et des dépenses supplémentaires à la procédure. Les quelques rapports sur l'encapsulation des protéines dans les aérogels rendent le développement de cette procédure une étape importante pour trouver une procédure plus générale pour encapsuler d'autres protéines dans les aérogels qui peuvent aider in potentiels futurs dispositifs bioanalytiques.
La section de protocole de ce manuscrit décrit comment synthétiser silice sol-gels, encapsuler cyt. C dans ces sol-gels, sécher ces sol-gels composites pour former des aérogels, caractérisent ces bioaerogels en utilisant la spectroscopie de dichroïsme UV-visible et circulaire et détecter la présence de l'oxyde nitrique en phase gazeuse avec ces bioaerogels. Cyt. C a été encapsulé avec succès dans des aérogels , lorsqu'il est dissous d' abord dans 4,4 à 70 mM de solutions aqueuses de tampon phosphate. Cependant, la structure des protéines optimisées aérogels a été constaté lors de l' encapsulation au résultat de 40 mM de phosphate de solutions tamponnées cyt. C produire chargé aérogel cyt. Les concentrations de C dans la plage de 5 à 15 um 9. Par conséquent, le protocole donné ci – dessous consiste à synthétiser aérogels en utilisant des solutions de phosphate 40 mM en tampon de cyt. C résultant en un cyt chargé. Concentration en C dans les aérogels de 15 uM. </ P>
Comme décrit, cette procédure a toujours produit cyt viable. C encapsulé dans aérogels. La concentration du cyt. C dans les aérogels peut varier de 5 à 15 uM et la concentration du tampon de la solution c cyt. Initiale encapsulée dans les aérogels peut faire varier de 4,4 à 70 mM de phosphate , sans effets néfastes graves sur la protéine de viabilité. Cependant, le centre de pointe et la largeur maximale de la cyt caractéristique. C Soret pic dans les aérogels sont les plus proches de ce qu'ils sont pour cyt. C en solution lorsque cyt. C est encapsulé dans des aérogels de solutions de tampon 40 mM 9.
La synthèse de la cyt. C -SiO 2 aérogels est affectée par l'âge de certains des réactifs de départ. Le méthanol, le tétraméthoxysilane, et une solution d'hydroxyde d'ammonium sont hygroscopiques et doivent être remplacés tous les un à deux mois. L'eau accrue qui se accumule dansces réactifs au cours du temps affecte les caractéristiques structurelles de gel et le temps de transition sol-à-gel.
Lors de séchage supercritique, le bateau de transfert du point critique appareil de séchage peut contenir jusqu'à dix-huit 0,5 cm d'épaisseur, 1 gels cm de diamètre. Comme il est indiqué dans la section de protocole, un remplissage spécifique et de la procédure de vidange doivent être suivies pour transférer le dioxyde de carbone dans les sols gels. Il est important de noter que, au début du protocole de vidange, le mélange de drainage de gaz carbonique et d'acétone circule à une vitesse élevée pour que le tube de vidange rigide congèle avec de l'humidité de condensation à la glace à l'extérieur. Le mélange vidangeant contient un peu d'eau puisque l'acétone est pas anhydre et cette eau peut parfois geler dans une mesure que le tuyau de vidange obstrue réellement. Il est nécessaire de surveiller ces sabots et à écouter pour un arrêt de l'écoulement. La vanne de vidange doit être fermé pendant quelques minutes afin que le sabot va fondre si un sabot est détecté. Dansle pire des cas, si le robinet de vidange est pas fermé, un sabot peut causer tant de pression pour construire ce que le tube de drainage apparaît avec force hors de l'appareil. Après les quelques premières périodes de vidange, la majorité de l'acétone aura été rincé hors de l'appareil, et la présence de morceaux de glace humide diminue de manière spectaculaire. La décharge va progressivement ressembler à de la glace sèche comme protocole de vidange se poursuit avec toute preuve résiduelle de la présence de l'acétone (comme parfum) devenir indétectable à la fin du processus de vidange.
Après que le dioxyde de carbone dans l'appareil a fait la transition de l'état liquide à fluide supercritique et le processus d' évacuation a commencé, il est nécessaire de libérer le fluide à une vitesse lente pendant au moins 45 min , comme indiqué dans le mode opératoire 9. Un taux de libération plus élevé peut diminuer la viabilité de cyt. C (comme le montre la figure 9) dans les aérogels et les aérogels se peut effectivement briser comme the fluide se précipite pour échapper aux gels. En général, même lorsque les aérogels restent intacts après l'ouverture de la porte de l'appareil, il est important de les manipuler avec soin et doucement comme ils sont fragiles et peuvent se casser facilement.
Les gels de silice de commande qui se déversent le long de la cyt. C -SiO 2 gels sont utilisés après séchage supercritique afin de déterminer si le transfert de dioxyde de carbone dans les gels a été réussie. Parfois , le cyt. C -SiO 2 gels peuvent sembler trouble et il est important de déterminer si cela est dû à un transfert incomplet solvant ou si elle peut avoir à faire avec la concentration de la cyt. C ou un tampon encapsulé dans les gels. Si les gels de silice sans cyt. C semblent avoir, un aspect translucide homogène tout au long, ce qui peut être considéré comme une preuve que le transfert de solvant a eu lieu complètement même si le cyt. C -SiO 2 gels ont une certaine nébulosité à eux. Nébulosité dans les gels de silicesans cyt. c après séchage indique que peu d' acétone est resté à l' intérieur des gels au cours de la ventilation.
Comme indiqué dans la section de protocole, les mesures de sécurité importantes doivent être prises lorsque l'on travaille avec de l'oxyde nitrique (NO). Pour détecter NO en utilisant les aérogels, il est nécessaire de sceller la cuvette très bien et d'épuiser le gaz circulant sur les aérogels dans une hotte. Sinon, l'ensemble spectrophotomètre peut être déplacé dans une hotte avec le NO bouteille de gaz comme une précaution supplémentaire pour limiter l'exposition au gaz NO. Au contact de l'air NO immédiatement produire le dioxyde d'azote, peroxyde d'azote hautement toxique, ou les deux. NO peut également réagir avec l'eau pour produire de la chaleur et corrosives fumées. Par conséquent, l'exposition prolongée au NO peut entraîner une toxicité directe des tissus.
Lorsque vous utilisez le cyt. C -SiO 2 aérogels pour détecter la présence d'oxyde nitrique, la bande Soret sera initialement à ~ 408 nm et se déplaceraà ~ 414 nm en présence d'oxyde nitrique. Après le passage de retour à l'azote, la bande Soret devrait revenir de nouveau à être centré à ~ 408 nm. Il peut également être possible d'utiliser la cyt. C -SiO 2 aérogels pour détecter la présence d'autres ligands tels que le monoxyde de carbone 27.
Différentes procédures publiées comprennent une étape supplémentaire consistant à combiner or ou d' argent avec des nanoparticules cyt. C dans la solution avant le mélange avec le sol et le séchage surcritique pour former des aérogels 4-8. La comparaison de la spectroscopie UV-visible de cyt. C encapsulée dans des aérogels avec des nanoparticules métalliques à celle de la cyt. C encapsulée dans des aérogels sans nanoparticules métalliques montre que ces deux types de techniques d'encapsulation produisent cyt. C de la viabilité similaire dans les aérogels (Figure 5) . Cependant, le cyt. C encapsulé avec des nanoparticules métalliques est légèrement plus stable que cyt. C encapsulerd sans nanoparticules métalliques dans les aérogels 9. Les spectres CD des deux types de cyt. C aérogels sont également similaires, même si les deux diffèrent du spectre de la cyt. C dans un tampon qui indique un certain déroulement de cyt. C dans les aérogels (figure 7). Les rapports précédents sur cyt. C encapsulées dans des aérogels suggèrent que la spectroscopie par dichroïsme circulaire est le plus susceptible d' évaluer la couche la plus externe de la protéine dépliée lors du contact avec le gel de silice, à l' intérieur soit en métal cyt plusieurs couches de nanoparticules nucléé. Structures C ou des structures plus ou moins organisés qui forment en l' absence de nanoparticules métalliques sont présents dans aérogels 4,9. La majorité de la cyt. C à l'intérieur de chaque structure de type auto-organisé à l' intérieur des aérogels reste pliée , telle que mesurée par la spectroscopie UV-visible cependant. L'avantage du protocole décrit des nanoparticules présentes sans que l'achat coûteux ou la synthèse de temps en métalles nanoparticules ne sont pas nécessaires. Les protéines ont pas souvent été encapsulés avec succès dans les aérogels, et ainsi cette procédure est importante en ce qu'elle peut conduire à l'élaboration d'une méthode plus générale pour encapsuler d'autres protéines dans les aérogels avec importance potentielle pour les futurs dispositifs bioanalytiques.
The authors have nothing to disclose.
Soutien pour ce travail et / ou de la publication a été fourni par l'Institut des sciences du Collège de l'Université Fairfield des Arts et des Sciences, Faculté de subventions de recherche de l'Université Fairfield, un Prix scientifique Cottrell College de la Société de recherche en sciences Advancement, Collège de l'Université Fairfield des Arts et des Sciences et Chimie et Biochimie Département de l'Université Fairfield. Nous tenons à remercier Jean Marie Wallace pour un aperçu beaucoup plus utiles et des conseils en ce qui concerne ce domaine de recherche générale. De plus, nous adressons un merci tout spécial à tous passés, actuels et futurs chercheurs de premier cycle du Research Lab Harper-Leatherman.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |