تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
يصف هذا البروتوكول تقنيات محددة تستخدم لتوصيف الحد نهاية (RE) وتسلسل غليكوزيل المنطقة الداخلية (ق) من heteroxylans. تم عزل دي منشى-جدران الخلايا السويداء القمح باعتباره بقايا الكحول غير قابلة للذوبان (AIR) (1) وبالتتابع استخراج مع الماء (W-سول الاب) و 1 M KOH تحتوي على 1٪ NaBH 4 (كوه-سول الأب) كما وصفها راتناياك وآخرون آل (2014) (2). واعتمد نهجين مختلفين (انظر ملخص في الشكل 1). في المرحلة الأولى، يتم التعامل AXS سليمة W-سول مع 2AB لوضع علامة الأصلي RE العمود الفقري بقايا سلسلة السكر وبعد ذلك تعامل مع endoxylanase لتوليد مزيج من RE-وصفت 2AB والمنطقة الداخلية والحد يغوساكاريدس، على التوالي. في النهج الثاني، وتحلل من الأب كوه-سول مع endoxylanase لتوليد أول خليط من يغوساكاريدس التي وصفت في وقت لاحق مع 2AB. صدر enzymically ((الامم المتحدة) الموسومة ب) يغوساكاريدس من كلاW- وFRS كوه-سول هي ثم مميثل والتحليل الهيكلي التفصيلي لكل من يغوساكاريدس الأم ومميثل يتم تنفيذ ذلك باستخدام مزيج من MALDI-TOF-MS، RP-HPLC-ESI-QTOF-MS وESI-MS ن. هضمها Endoxylanase تتميز كوه-سول AXS أيضا الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي) الذي يقدم أيضا معلومات عن التكوين المصاوغ الكربونيلي. ويمكن تطبيق هذه التقنيات إلى فئات أخرى من السكريات باستخدام إندو-هيدروليز المناسبة.
Introduction
Heteroxylans أسرة مكونة من السكريات التي هي الغالبة السكريات غير السليلوزية من الجدران الأساسية من الأعشاب والجدران الثانوية من جميع كاسيات البذور 3-6. العمود الفقرى الزيلان تختلف في أنواعها وأنماط الاستبدال مع غليكوزيل (حمض الغلوكورونيك (GlcA)، أرابينوز (عارف)) وغير غليكوزيل (O-أسيتيل، وحمض الفيرليك) بقايا اعتمادا على نوع الأنسجة، ومرحلة التطوير والأنواع 7.
جدران من القمح وتتكون (الحنطة ايستيفوم L.) السويداء في المقام الأول من arabinoxylans (AXS) (70٪) و (1 → 3) (1 → 4) -β جلوكان-D (20٪) مع كميات ضئيلة من السليلوز وheteromannans (2٪ لكل منهما) 8. قد يكون العمود الفقري الزيلان الامم المتحدة واستبداله بأشكال مختلفة وفي الغالب (في المقام الأول O-2 موقف وإلى حد أقل O-3 موقف) استبدال أحادي و (O-2 و O-3 وظائف) مع α-L-آرا استبداله دى المخلفات و 9. نهاية الحد (RE) من مغايرxylans من dicots (على سبيل المثال، نبات الأرابيدوبسيس thaliana) 10 وعاريات البذور (على سبيل المثال، شجرة التنوب (ABIES Picea)) 11 يحتوي على سمة تسلسل رباعي السكاريد غليكوزيل. -β-D-XYL ص – (1 → 3) -α-L-رحه ع – (1 → 2) -α-D-غال ص A- (1 → 4) -D-XYL ص. لفهم الحيوي heteroxylan وظيفة (البيولوجية والصناعية)، فمن المهم أن تسلسل كامل العمود الفقري الزيلان لفهم أنواع وأنماط من التبديلات فضلا عن سلسلة من نهاية الحد (RE).
ووصف تقنيات محددة تستخدم لتوصيف هيكلي للحد من نهاية (RE) وتسلسل غليكوزيل المنطقة الداخلية (ق) من heteroxylans في هذه المخطوطة. تقنيات تعتمد على fluorophore علامات (مع 2 aminobenzamide (2AB)) والحد من نهاية (RE) من سلسلة heteroxylan قبل الأنزيمية (endoxylanase) التحلل. هذا النهج، لا سيما بالنسبة للتسلسل RE، كانلاول مرة من قبل المختبر نيويورك 10،12-13 لكن الآن امتد ليشمل المنطقة التسلسل الداخلي وهو مزيج من التقنيات الراسخة التي هي قابلة للتكيف بشكل متساو على جميع heteroxylans مستقلة عن مصدرها من العزلة. ويمكن أيضا أن هذا النهج يتم تطبيقها على فئات أخرى من السكريات باستخدام (إن وجدت) وإندو-هيدروليز المناسبة.
في هذه الدراسة، تم عزل جدران الخلايا السويداء القمح منشى دي باعتبارها بقايا الكحول غير قابلة للذوبان (AIR) وبالتتابع استخراج مع الماء (W-سول الاب) و1M KOH تحتوي على 1٪ NaBH 4 (كوه-سول الأب) كما هو موضح في راتناياك وآخرون (2014) (2). ويغوساكاريدس صدر من كلا W- وFRS كوه-SOL ثم يتم مميثل والتحليل الهيكلي التفصيلي لكل من يغوساكاريدس الأم ومميثل يتم تنفيذ ذلك باستخدام مزيج من MALDI-TOF-MS، ESI-QTOF-MS إلى جانب مع HPLC مع الفصل الكروماتوغرافي الانترنت باستخدام RP العمود C-18وESI-MS ن. هضمها Endoxylanase كان كوه-سول AXS تتميز أيضا الرنين المغناطيسي النووي (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
ومعظم المرحلة مصفوفة السكريات جدار الخلية على ما يبدو بديلا عشوائيا العمود الفقرى (مع كل غليكوزيل والمخلفات غير غليكوزيل) التي تختلف اختلافا كبيرا تبعا لنوع من النباتات، ومرحلة النمو ونوع الأنسجة 3. منذ السكريات هي منتجات الجين الثانوية تسلسلها لا قالب اشتقاق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
