רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקות הספציפיות משמשות לאפיו של צמצום הסוף (RE) ורצף glycosyl באיזור הפנימי (ים) של heteroxylans. קירות התא חיטה האנדוספרם-מעומלנים דה בודדו כמו שאריות אלכוהול מסיס (AIR) 1 ברצף חילוץ עם מים (W-סול ו') ו 1 M KOH המכיל 1% 4 NaBH (Koh-סול ו') כפי שתואר על ידי ראת'נייקה et al. (2014) 2. שתי גישות שונות (ראו סיכום באיור 1) יאומצו. בחלק הראשון, ללא פגע W-סול AXS מטופלים עם 2AB לתייג את שאריות סוכר שרשרת עמוד שדרת RE המקוריות ולאחר מכן שטופל endoxylanase כדי ליצור תערובת של RE 2AB שכותרתו באיזור הפנימי הפחתת אוליגוסכרידים, בהתאמה. בגישה השנייה, Koh-סול ו'הוא הידרוליזה עם endoxylanase לייצר הראשון תערובת של אוליגוסכרידים אשר מסומנים ובהמשך עם 2AB. שוחרר enzymically ((un) מתויג) אוליגוסכרידים משניפ-ו FRS-סול KOH אז הם מפוגל בניתוח מבני מפורט של שני אוליגוסכרידים יליד מפוגל מתבצע באמצעות שילוב של MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS ו- ESI-MS n. Endoxylanase מתעכל KOH-סול AXS מאופיינים גם על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כי גם מספק מידע על תצורת anomeric. ניתן ליישם טכניקות אלה לשיעורים אחרים של סוכרים באמצעות אנדו-hydrolases המתאים.
Introduction
Heteroxylans הם משפחה של סוכרים כי הם סוכרים שאינם מתאית השולט של הקירות העיקרי של עשבים הקירות משני של כל מכוסי הזרע 3-6. על גבותיהם xylan נבדלים סוגים שלהם ואת דפוסי התחלופה עם glycosyl (חומצה גלוקורונית (GlcA), arabinose (עראף)) והלא-glycosyl (O-אצטיל, חומצה ferulic) שאריות בהתאם לסוג הרקמה, השלב ההתפתחותי ומינים 7.
חומות מחיטה האנדוספרם (Triticum aestivum L.) מורכבים בעיקר של arabinoxylans (AXS) (70%) ו- (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucans (20%) עם כמויות קטנות של תאית heteromannans (2% כל אחת) 8. עמוד השדרה xylan עשוי להיות שונות בלתי להחליף ו בעיקר מונו מחליפים (בעיקר O-2 עמדה ובמידה פחותה O-3 עמדה) ו di-להחליף (O-2 ו- O-3 עמדות) עם α-L-ערה f שאריות 9. סוף הצמצום (RE) של הטרוxylans מ dicots (למשל, thaliana ארבידופסיס) 10 ו חשופי הזרע (למשל, אשוחית (אַשׁוּחַ Picea)) 11 מכיל רצף glycosyl tetrasaccharide מאפיין; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-RHA p – (1 → 2) -α-D-גל p A- (1 → 4) -D-Xyl p. כדי להבין heteroxylan ביוסינתזה ותפקוד (ביולוגי ותעשייתיים), חשוב שממפה את עמוד השדרה xylan מלא להבין את סוגי ואת דפוסי החלפות וכן רצף של סוף צמצום (RE).
טכניקות ספציפיות משמשות לאפיו המבניים של צמצום הסוף (RE) ורצף glycosyl באיזור הפנימי (ים) של heteroxylans מתוארות בכתב היד הזה. הטכניקות להסתמך על fluorophore תיוג (עם 2 aminobenzamide (2AB)) את צמצום סוף (RE) של שרשרת heteroxylan לפני הידרוליזה אנזימטית (endoxylanase). גישה זו, במיוחד עבור רצף RE, היהדיווח לראשונה על ידי מעבדת יורק 10,12-13 אך מוארך בשלב זה לכלול את הרצף באזור הפנימי הוא שילוב של טכניקות נקבעו כי ניתן להתאמה לכל במידה שווה heteroxylans העצמאית של מקור בידודם. גישה זו יכולה לחול גם על סוגים אחרים של סוכרים אלקטרוניים (בהתאם היצע) את אנדו-hydrolases המתאים.
במחקר הנוכחי, קירות התא האנדוספרם חיטה מעומלנים דה בודדו כמו שאריות אלכוהול מסיס (AIR) ברצף חילוץ עם מים (W-סול ו') ו 1M KOH המכיל 1% 4 NaBH (Koh-סול ו') כמתואר ב ראת'נייקה et al. (2014) 2. אוליגוסכרידים שוחררו משני פ-ו FRS-סול KOH אז הם מפוגלים בניתוח המבנים המפורט של שני אוליגוסכרידים היליד המפוגלים מתבצע באמצעות שילוב של MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS מצמיד עם HPLC עם הפרדת chromatographic באינטרנט באמצעות טור RP C-18ו ESI-MS n. Endoxylanase מתעכל KOH-סול AXS אופיינה גם תהודה מגנטית גרעינית (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב שלב מטריקס סוכרי דופן התא החליפו לכאורה באקראי עמוד שדרה (בשני glycosyl ושאריות שאינם glycosyl) כי הם מאוד משתנים בהתאם מיני צמחים, שלב ההתפתחותי ורקמות סוג 3. מאז סוכרים הם מוצרים משניים גן הרצף שלהם אינו תבנית נגזר ולכן אין גישה אנליטית יחידה, כגון קיימת עבור חומצו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
