자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

다음 절차는 실험 동물의 사용 및 비전 및 안과 (ARVO) 연구 협회에서 안과에서 동물의 사용 및 Visual 연구를위한 정책에 대한 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침을 준수 하였다. 전방 내원시 주입을위한 미세 1. 준비 풀러 통해 보로 실리케이트 유리 모세관으로부터 미세 생성 현미경 신중 미세 바늘의 선단부에 개구를 생성하기 위해 날카로운 칼날을 사용한다. 얻어진 개구는 각각 약 190 ㎛ 내지 70 ㎛의 주요 및 부축 직경을 갖는 타원 형상을 가져야한다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량 한 다음 현미경으로 배치 된 눈금자 제 취득 화상에 의해 제조 된 미세 개구의 면적을 측정한다. 마이크로 피펫의 연삭 값 시스템에서, 20 degre에서 미세 배치연삭 값 판에 전자 각도 미세 바늘 구멍이 판을 만지지 않도록. 베벨 가장자리까지 약 10 분 평평하고 매끄러운이기 때문. 프로세스에 도움을 증류수로 몇 방울을 추가한다. 끝이 날카로운 될 때까지 개방을 둘러싼 두 개의 가장자리를 베벨하는 미세 바늘을 돌립니다. 에어로졸 살포를 사용하여 미세 팁 오프닝에서 청소 모든 먼지와 물. 조심스럽게 현미경 완성 된 미세 바늘을 검사합니다. 골절 취소 미세 바늘 수술 중에 미세 바늘 파괴의 위험을 최소화합니다. 다음 멸균 평형 염 용액 (BSS)과, 에탄올로 세정하여 제 미세 멸균. 마그네틱 마이크로 비드 솔루션 2. 준비 참고 : 본 연구에 사용 된 자성 마이크로 비드는 에폭시기로 코팅된다. 같은 구슬의 응집 및 원치 않는 분자 상호 작용 같은 부작용을 방지하려면 다음 에폭시 그룹은해야합니다먼저 주입 수술을 진행하기 전에 마이크로 비드로부터 제거 될 수있다. 자석 구슬에서 에폭시 그룹의 제거 배 트리스 완충액, 0.02 M 수산화 나트륨 (NaOH로, MW 39.997 g / 몰)의 용액 (MW 121.14 g / 몰)을 준비한다. 부드럽게 자성 마이크로 비드 용액 재고 와동 (4.5 μm의 직경, 4 × 10 8 비드 / ㎖) 비드 균일 용액에 현탁 될 때까지. 배 빠르게 트리스 완충액에 0.02 M NaOH를 50 ㎖에 자성 비드 용액 1 ㎖를 피펫. 구슬에서 에폭시 그룹을 제거하기 위해 RT에서 24 시간 동안 회전합니다. 상기 튜브의 하단에 자석을 고정하여 비드를 모은다. 모든 구슬이 자석에 매료되도록 수평 관의 방향. 실온에서 추가로 4 시간 동안 회전합니다. 마이크로 피펫으로 조심스럽게 구슬의 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 부드럽게 배 T 50ml에 펠릿 와동구슬이 잘 일시 중단 될 때까지 RIS 버퍼. 반복 2.1.6에 2.1.4 단계를 반복합니다. 농도 및 무균 균형 소금 솔루션에서 자기 마이크로 비드의 재 부유 주 : 2.4 × 106 비드 A의 전방 챔버로 주입 될 수 있도록 1.6 × 106 비즈 / μL의 최종 농도에 도달하기 위해 멸균 평형 염액 자석 구슬 용액 재고 집중할 필요 작은 마우스의 눈에 적합한 1.5 μL의 최종 부피. 부드럽게 2 분 동안 텍싱에 의해 매우 순수 실험실 수준의 물 5ml에 구슬을 씻으십시오. 자석과 상기 튜브의 저부로 흡인하여 비드를 모은다. 마이크로 피펫으로 조심스럽게 구슬의 펠렛을 방해하지 않고 물을 제거합니다. 반복 2.2.1 2.2.3에 세 번 이상 반복합니다. 층류 후드에서 pipettin하여 BSS 500 μL와 비드 세척상하 g. 층류 후드에서 무균 조건에서이 섹션의 나머지 단계를 수행합니다. 자석과 상기 튜브의 저부로 흡인하여 비드를 모은다. 마이크로 피펫으로 조심스럽게 구슬의 펠렛을 방해하지 않고 BSS를 제거합니다. 반복 2.2.5 2.2.7에 세 번 이상 반복합니다. 상하 BSS 250 μL의 구슬을 피펫 팅에 의해 재현 탁. 비드 솔루션은 잘 균질화 있는지 확인합니다. 그 후, 빠르게 멸균 0.5 ㎖의 튜브에 현탁액 25 μL 나누어지는. 재고 비드 용액의 최종 농도는 1.6 × 106 비즈 / μL이다. 4 ℃에서 보관하십시오. 안구 고혈압의 3. 유도 참고 : 3 절은 두 사람의 작업입니다. 특정 조치가 특정 사용자에 의해 수행되는 경우, 해당 사용자가 식별된다. 사람이이 R 인 동안 일반적 이용시 1 현미경으로 마우스를 처리마이크로 실린 펌프를 조작하기위한 잖소. 수술의 총 지속 시간보다 10 분이어야한다 (3.17-3.9 단계). 성인 C57BL / 6 마​​우스에서 절차를 수행합니다. 음식과 물을 광고 무제한에 액세스 할 수있는 표준 환경에서 하우스 마우스. 본 논문에서는 3 세 4.5 개월 사이에 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 유전자 녹아웃 마우스를 비롯한 남성 및 다양한 연령대의 마우스뿐만 아니라 다른 마우스 균주에 적용 할 수있다. 교정 리바운드 안압계를 사용하여 이전에 마취 및 마이크로 비드 주입에 깨어 마우스에서 기준 안압을 측정합니다. 각막에 proparacaine 염산염 한 방울을 적용합니다. 조심스럽게 귀 사이의 피부를 잡고 마우스를 억제. 동물이 편안하고 눈에 액세스 할 수 있도록 벤치 탑에 마우스를 놓습니다. 각막 표면에 수직 안압계를 잡고과를 얻기 위해 눈 당 열 연속 판독 적어도 3 세트 걸릴IOP의 평균. 깨어 마우스에서 안압의 측정은 IOP에 마취 관련 효과를 우회하는 것이 바람직하다. 또한, IOP 단계 3.4 이후 anesthetised 마우스에서 측정 할 수있다. 20 ㎎ / ㎖ 케타민, 2 ㎎ / ㎖ 자일 라진, 0.4 ㎎ / ㎖ 아세 프로 마진으로 구성된 주식 마우스 칵테일 마취 혼합물을 준비합니다. 칵테일 혼합 (체중의 1 μL / g)의 복강 내 투여에 의해 마우스의 마취를 유도한다. 동물은 흡입 마스크에 접속되지 않는 마우스 헤드를 운반 할 때 유연성을 허용하기 때문에 주사 마취 칵테일의 사용은 (예를 들면, 이소 플루 란) 가스 마취제를 통해 바람직하다. 또한, 주사​​ 마취 필요한 긴 회복 기간은 마이크로 비드 전방에 다시 빠지 않고 홍채 각막 각도 정착 것을 보장한다. 부 프레 노르 핀의 피하에 체중 kg 당 0.05 mg의 투여. tropicamide의 EY으로 눈을 치료전자 동공 팽창을 유도 놓습니다. 뮤린 인해 전방의 작은 크기, 퓨필 쉽게 주입시 미세 바늘의 위치 및 전진을 시각화 넓혀진되어야한다. 절차를 수행하는 동안 각막의 건조를 방지하기 위해 반대편 눈 (미 작동)에 국소 연고를 적용합니다. 마이크로 실린 펌프의 주입 어셈블리에 깨끗한 미세 바늘을 연결합니다. 크로스 동물의 오염을 방지하기 위해 모든 작업 후 미세 바늘을 교체합니다. 사람 1 : 운영 플랫폼에 anesthetised 마우스를 전송합니다. 현미경, 동공이 완전히 팽창 된 것이 더 안구 운동이 없도록 안구 근육 이완 것을 보장한다. 안구 운동의 부재는 사출 동안 안정성을 보장한다. 부드럽게 흡수 면봉을 사용하여 눈의 tropicamide 눈 방울을 닦아냅니다. 사람 2 :로 pipetting 아래로 자기 마이크로 비드 솔루션을 섞는다. 마이크로 실린 펌프를 사용하여 즉시 MICR로드oneedle 균질 자성 마이크로 비드 용액 (2.4 × 10 6 구슬)의 1.5 μL와 (섹션 1에서 제조). 그 기포가 미세 바늘의 끝에 존재되도록. 미세 바늘이로드 된 후 수행 자성 마이크로 비드 용액이 균질 한 현탁액을 유지하도록 가능한 한 빨리 3.12 3.13 단계. 윤부에 전방의 상대 위치를 45 ° 각도로로드 된 미세 바늘을 배치합니다. 이용시 1 : 플라스틱 집게를 사용하여 눈을 지원한다. 미세 바늘 및 플라스틱 집게 사이의 각도는 약 90 ° 있는지 확인하십시오. 이용시 2 : 미세 바늘의 선단이 전방에 진입하도록 적재 미세으로 부드럽게 각막 천공. 로드 된 미세 바늘이 찔린 동안 윤부에 45 °의 각도로 남아 있는지 확인합니다. 렌즈 나 조리개와의 접촉을 피하십시오. 미세 바늘이 후방 챔버를 입력하지 않도록하십시오. 이용시 1 : 눈을 계속 지원플라스틱 집게를 사용. 이용시 1 : 마우스 헤드를 이동하지 않고, 전방에 자성 비드를 끌어 각막의 내면 비드의 접촉을 최소화하기 위해, 대향하는 미세 바늘 팁 눈 옆의 자석을 배치했다. 이용시 2 : 마이크로 실린 펌프를 사용하여이 전방으로 자성 비드 용액 1.5 μL를 주입. 마이크로 비드 용액을 15 내지 30 초에 걸쳐 주입한다. 사람 1 : 주입의 전체 기간 동안 미세 팁에 자석 반대를 계속 누르고 있습니다. 이용시 2 비드의 전체 부피가 주입되면 천천히 눈에서 미세 철회. 사람 1 : 마이크로 비드의 역류를 방지하기 위해, 추가로 30 ~ 60 초 동안 옆에 눈에 자석을 잡고 전방을 향해 자기 구슬을 유치하는 것을 계속한다. 이용시 1 : 자석을 이용은 홍채 각막 각도 구슬을 끈다. 구슬이 균일하게 분포 고리를 형성하는지 확인전방의 둘레 주위에. 이 단계 동안, 그들이 접촉시 각막의 내면에 부착되는 경향을 갖지으로 각막 비드 유치 피한다. 감염의 위험을 최소화하기 위해 항생제 점안하여 안구 동작을 처리한다. 마우스 (~ 3-4 시간) 잠에서 깨어 때까지 열 패드를 복구 할 수 있습니다. 조작 된 눈이 위쪽으로 향하도록 마우스를 놓습니다. 이 위치는 중력에 의한 각막의 내면에 주입 된 비드 축적을 방지 할 것이다. 또한,이 위치는 조작 눈 임의 침구 및 / 또는 케이지에 존재할 수있는 다른 물질과 접촉하지 않으므로 감염의 가능성을 감소한다. 필요에 따라 동물이 고통의 흔적을 표시하는 경우, 부 프레 노르 핀의 추가 용량을 관리 할 수​​ 있습니다. 마우스 안압 측정을하기 전에 적어도 2 일 동안의 절차를 복구 할 수 있습니다. 3.2에 설명 된대로 안압을 측정합니다. 모니토 IOP 적어도 일주일에 한번 또는 필요한만큼 자주, 그리고 하루 동시에 주기성 관련 변동을 최소화한다. 안압 측정을 위해 내부 통제로 운영 마우스에서 반대편 눈을 사용합니다. 또한, 손상, 비 조작 또는 가짜로 작동하는 마우스와 같은 순진한 컨트롤에서 측정 값을 사용합니다. 4. 평가 망막의 신경절 세포 소마와 축삭 생존 즉시 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)이어서 0.1 M 인산 완충 용액 (PBS)의 intracardial 주사 안압 실시 쥐 관류. 4.1에 기재된 바와 같이 본래 비 작동 쥐를 관류하고 손상되지 않은 대조군으로 사용할. 운영 마우스의 반대편 눈의 사용은 부상 다음 반대편 눈의 변화가 15, 16을보고되었습니다 및 데이터 해석을 혼동 할 수 있기 때문에 RGC 생존을 평가하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 사용 가짜 운영의 눈은 1 주입컨트롤과 같은 BSS의 0.5 μL. microscissors를 사용하여 조심스럽게 눈 소켓에서 분리하는 눈 주위의 결합 조직을 잘라. 시신경 헤드의 레벨을 절단하여 눈의 시신경을 분리한다. 30 G 바늘을 사용하여, 눈에 정착 제 용액의 침투를 허용하는 막에 구멍을 만든다. 4 % PFA에 눈을두고 추가 고정 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. (MW : 214g / mol)의 2 % PFA 0.1 M 나트륨 cacodylate에서 2.5 %의 글루 타르 알데히드를 함유 한 용액에 시신경을 놓고 추가 고정 4 ℃에서 O / N을 품어. 5. RGC 소마 농도의 정량화 평면 탑재 망막 . 다음 절차는 나달 – 니콜라스 등 (17)에 의해 프로토콜에서 적응되어 망막 평면 마운트에 뇌의 특정 호 메오 박스 / POU 도메인 단백질 3A (Brn3a)에 대한 항체를 이용하여 망막 신경절 세포의 정량을 간략하게 설명합니다. 대체 메트라벨 망막 신경절 세포에 대한 ODS는 Fluorogold 또는 DII 여러 스 플라이 싱 (RBPMS) 또​​는 역행 표시와 RNA 결합 단백질에 대한 항체와 면역 조직 화학을 포함하여 사용할 수 있습니다. 해부 현미경 각막 쉽게 분리 될 때까지 전체 윤부 따라 절개함으로써 눈의 앞쪽 부분을 제거한다. 각막과 렌즈를 제거합니다. 조심스럽게 오라 세라와 시신경을 따라 절개함으로써 눈의 망막을 분리합니다. 분명 네 망막 사분면을 묘사하는 시신경으로 망막의 주변부에서 4 개의 작은 등거리 절개를하여 망막 평면 마운트를 준비합니다. 작은 브러시를 사용하여 부드럽게 망막에 남아있는 유리체를 제거합니다. 가급적 유리체의 제거는 깨끗하고 강한 면역 신호를 얻기 위해 중요하다. 망막이되도록 조심스럽게 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 48 웰 평면 바닥 배양 판 망막 전송자유 부동. 신경절 세포 층이 위쪽으로 향하게되어 있는지 확인합니다. 15 분 동안 -70 ℃에서 배양 접시를 놓습니다. 신선한 PBS 2 % 트리톤 X-100으로 두 번 세척하여 망막, 상기 Permeabilize 하시려면 해동 후. PBS 2 % 트리톤 X-100, 2 % 정상 당나귀 혈청을 함유하는 용액으로 0.5 μg의 / – 0.3로 Brn3a 항체 희석. 부드럽게 4 ° C에서 O / N을 흔들어 Brn3a 차 항체 용액에 망막을 품어. 망막은 완전히 항상 액의 150 ~ 200 μL에 몰두해야한다. PBS 2 % 트리톤 X-100을 함유하는 용액으로 2 μg의 /에 당나귀 항 – 염소 IgG를 이차 항체를 희석하고 온화한 진탕하에 실온에서 2 시간 동안이 용액에 망막 배양한다. 망막 완전히 시점의 항체 용액에 침지한다. 광표백되지 않도록 나머지 단계를 알루미늄 호일로 배양 플레이트를 커버. 조직은 POS로 평평하게 놓여 있도록 브러시를 사용하여 조심스럽게 슬라이드에 망막을 전송sible. 10 분 동안 공기 건조. 안티 – 페이드 장착 매체를 이용하여 마운트합니다. 형광 현미경으로 망막 평면 마운트를 검사합니다. 설명에 따라 망막 사분면 당 세 개의 비 중첩 영역에서 Brn3a 긍정적 인 망막 신경절 세포의 수를 정량화. (18) 시신경 교차 섹션에 RGC 축삭의 6 정량화 4.5 단계에서 시신경을 수집하고 2 시간 동안 2 %의 산화 오스뮴에 (OSO 4, MW 254.23 g / 몰)을 품어. 주의 : 높은 독성으로 인해, 산화 오스뮴은 적절한 실험실 복장과​​ 흄 후드에서 처리되어야한다. 15 분마다 (50 %, 70 %, 90 %, 95 % 및 100 %), 에탄올의 농도를 증가시키는 침지하여 시신경 탈수. 다음의 레서피를 이용하여 에폭시 수지를 제조 : 15.72 mL를 매입 (812), 도데 세닐 무수 숙신산 6.45 ㎖, 7.83 ml의 메틸 나드 산 무수물, 0.45 mL의 DMP-30. 순차적으로 구성된 솔루션의 시신경을 배양0 : 1, 1 : 1, 0.75 : 0.25 내지 1 : 다음의 프로필렌 옥사이드로 에폭시 수지의 비율 (MW 58.08 g / mol)을 0. 시신경은 O / N 기간 RT 각 용액에 배양한다. 추가로 48 시간 동안 60 ℃에서 100 %, 에폭시 수지 (6.4 마지막 단계)에 매립 시신경 부화. 마이크로톰을 이용하여 반 얇은 시신경의 단면 (0.75 μm의)를 생성합니다. 1 % 톨루이딘 블루와 시신경의 단면을 얼룩. 설명 (19) 각 시신경 섹션의 다섯 겹치지 않는 영역에서 RGC 축삭을 정량화.