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Immunology and Infection

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Published: February 12, 2016
doi:
10.3791/53658
, , , ,
1Ischemia Research Unit,Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Fraunhofer Research Institution for Marine Biotechnology,University of Lubeck, 3Department of Neurology,University of Leipzig

Summary

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Abstract

acidente vascular cerebral isquémico inicia uma resposta inflamatória robusto que começa no compartimento intravascular e envolve a activação rápida de células residentes cérebro. Um mecanismo de chave desta resposta inflamatória é a migração de células circulantes do sistema imunológico para o cérebro isquémico facilitada pela libertação de quimioquinas e maior adesão endotelial molécula de expressão. leucócitos-invadindo cerebrais são bem conhecidos contribuindo para início de carreira lesão isquêmica secundária, mas a sua importância para a rescisão de inflamação e reparação do cérebro depois só recentemente foi notado.

Aqui, um protocolo simples para o isolamento eficiente de células do sistema imunológico do cérebro isquémico rato é fornecida. Após a perfusão transcardial, hemisférios cerebrais são dissecados e mecanicamente dissociados. A digestão enzimática com Liberase é seguido por gradiente de densidade (como Percoll) centrifugação para remover os detritos celulares e a mielina. Uma grande vantagem deste protocolo Is o procedimento de gradiente de densidade de camada única que não requer preparação demorada de gradientes e pode ser realizada de forma fiável. A abordagem produz contagens de células altamente reprodutíveis por hemisfério cerebral e permite a medição de vários painéis de citometria de fluxo em um replicado biológica. Caracterização fenotípica e quantificação de leucócitos-invadindo cérebro após um AVC experimental pode contribuir para uma melhor compreensão dos seus papéis multifacetados em lesão isquêmica e reparação.

Introduction

O acidente vascular cerebral desencadeia uma resposta inflamatória sustentada que começa rapidamente após a interrupção do fluxo de sangue local e envolve praticamente todas as partes do sistema imunitário. Uma característica importante desta resposta inflamatória é um influxo temporizada de células imunes para o cérebro, que é accionado pela activação de células endoteliais cerebrais, a secreção de quimiocinas e aumento substancial fluxo simpático 1-3. Infiltração de células inflamatórias já foi considerado nocivo no AVC isquémico, no entanto, vários ensaios clínicos de tratamento destinadas a bloquear indiscriminadamente leucócitos saída para o cérebro não conseguiu induzir um benefício clínico mensurável 4. Mais recentemente, tornou-se evidente que as células derivadas de monócitos inicialmente envolvidos na progressão do dano isquémico 5 pode também desempenhar um papel fundamental para a resolução da inflamação e reparação de tecidos subsequente 6.

Graças à identificação de fenótipos e functiheterogeneidade onal entre os monócitos e macrófagos, o conhecimento sobre o papel dos fagócitos mononucleares em desenvolvimento e resolução da inflamação expandiu significativamente. Em ratinhos, os monócitos circulantes podem ser classificados em pelo menos dois subconjuntos funcionalmente distintos de acordo com a sua expressão à superfície de antigénio de linfócitos 6 complexo (Ly-6C) 7. Enquanto Ly-6C elevados monocytes''inflammatory foram claramente demonstrado que é essencial para o controlo de infecções bacterianas 8, o seu papel na lesão estéril é mais controverso. No acidente vascular cerebral isquêmico, a ablação seletiva de altas monócitos CCR2 + Ly-6C resultou em hemorrágico transformação enfarte 6. No entanto, a mesma abordagem experimental melhorou incapacidade aguda após hemorragia intracerebral 9. Da mesma forma, acredita-diferentes subconjuntos de células T para exercer tanto acções prejudiciais de protecção 10 ou 11 em lesão cerebral isquémica, no entanto, os dados são controversial 12,13 e merece mais investigações. Dada essa complexidade crescente, torna-se claro que o conhecimento mais profundo sobre os papéis das células imunitárias diversificadas lesão isquêmica e reparação é crucial para traduzir descobertas experimentais em terapias enfocadas inflamação pós acidente vascular cerebral.

Hoje, a mais poderosa ferramenta para analisar as respostas imunes celulares é citometria de fluxo policromática. Ele permite a identificação e quantificação de vários subconjuntos de células imunitárias no local da inflamação, sem a necessidade de influenciar o sistema por meio de etiquetagem in vivo ou manipulação genética 14. Coloração simultânea de marcadores de superfície celular com anticorpos contra citocinas intracelulares 15 ou fatores de transcrição 16 fornece, adicionalmente, informações sobre o estado funcional das células individuais, fenotipicamente identificados. Como um inconveniente principal, suspensões de células únicas são necessárias para ensaios de citometria de fluxo e, portanto, informação sobre loczação de infiltrados celulares está perdido. No entanto, embora a histologia é ideal para ganhar informação espacial, que é limitada pelo número de anticorpos que podem ser utilizados de uma só vez para caracterizar subtipos de células imunes num tecido particular. Hoje, a combinação da presença e na ausência de vários marcadores de superfície é necessária para identificar inequivocamente subconjuntos de células imunitárias raras, especialmente as populações de células derivadas de monócitos durante a inflamação distintas 17.

Aqui, descrevemos um protocolo eficiente para isolar um elevado número de leucócitos a partir do cérebro do rato pós-isquêmica utilizando um gradiente simples densidade de camada única. As suspensões de células podem ser obtidos quer analisado por fluxo multi-dimensional de citometria ou ainda ser enriquecido por triagem de citometria de fluxo ou selecção imunomagnética para realizar análises a jusante altamente específicos. O método detalhes perfusão transcardial, remoção de hemisférios cerebrais, a dissociação do tecido cerebral em susp única célulaensões, centrifugação em gradiente de densidade para a remoção da mielina, bem como coloração com anticorpos para a análise de citometria de fluxo.

Protocol

Todos os experimentos com animais devem estar em conformidade com as normas de acordo para o cuidado de animais (por exemplo., O Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo US National Institutes of Health, NIH Publication No. 85-23, revista em 1996) e têm de ser aprovados pela autoridade estadual competente. 1. Preparação dos Reagentes Tampão de digestão (1 ml por hemisfério): Dissolve-se uma mistura padronizada de enzimas digestivas purificadas, por exemplo, Liberase com concentração termolisina baixo (TL) para uma concentração de 2U / ml em salina equilibrada de Hanks Solution (HBSS) contendo cálcio (Ca) e magnésio (Mg) Tampão de lavagem com DNase: Dissolver ADNase I a uma concentração de 666U / ml em HBSS (Ca / Mg livre) contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) Lavar tampão sem DNAse: HBSS (Ca / Mg livre) contendo 10% de FCS Média densidade gradiente (5 ml por hemisfério): prepare gradiente de densidade isotônica estoque0; médio (SIP; 100%) por mistura de nove partes de meio de gradiente de densidade com uma parte de cloreto de sódio 1,5 M. Diluir SIP a densidade de 25% por adição de um volume apropriado de HBSS (Ca / Mg livre) contendo 3% de FCS A citometria de fluxo tampão (FC): Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 3% de FCS 2. Transient Middle Cerebral Oclusão da Artéria NOTA: a oclusão transiente da artéria cerebral média (MCAO) através da técnica de sutura intraluminal foi realizada como descrito anteriormente 18 em 12 semanas de idade do sexo masculino ratinhos C57BL / 6. Resumidamente, anestesiar ratos com 2,0% de isoflurano em 100% de oxigênio. Manter a temperatura do corpo a 36,5 ° C ± 0,5 ° C por um dispositivo de aquecimento controlado por realimentação. Após a ligação da artéria carótida comum e a artéria carótida externa, introduzir um monofilamento revestido de silicone-borracha normalizada na artéria carótida comum e avanço para a origem do meio Cartéria erebral. Após 45 min remover o filamento para permitir a reperfusão. Em animais sham-operado, retirar imediatamente o filamento Após a oclusão da artéria cerebral média para evitar a isquemia. 3. transcardial perfusão e Cérebro Dissection Prepare uma bomba de perfusão peristáltica por imersão uma extremidade da mangueira na HBSS gelada (Ca / Mg livre). Fixar uma agulha romba 23 L para a outra extremidade do tubo de perfusão e ligar a bomba para encher completamente o tubo com HBSS (Ca / Mg livre). Profundamente anestesiar mouse com 4% de isoflurano e eutanásia por inalação de CO 2. Coloque dorsal do rato em uma placa de dissecção incorporado em uma bandeja de plástico. fore propagação e as patas traseiras mais ampla possível e corrigi-los na placa de dissecção com 20 g de agulhas. Agarre pele abdominal com uma reta 1 x 2 dentes pinça e usar a tesoura de íris afiadas para fazer uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal e expor afígado. Levante o esterno e incisão no diafragma com a lâmina sem corte de agudos / contundentes íris tesoura. Continuar a cortar a caixa torácica lateral, em ambos os lados na direção caudocranial. Tenha cuidado para não ferir o pulmão, o coração e as artérias torácicas. Levante a aba da pele com uma pinça sem corte e fixá-lo na placa de dissecação. Use uma pinça blunt-end e uma tesoura para separar cuidadosamente o coração de tecido conjuntivo. Segurar coração com um blunt-end fórceps e insira a ponta da agulha romba 23 L, com o tubo anexado perfusão no vértice do ventrículo esquerdo. Nota: Não inserir a agulha muito longe para o ventrículo esquerdo para evitar lesões do septo interventricular. Se necessário, corrigir a cânula no lugar com um fórceps afiadas retas. Incisão no átrio direito com uma tesoura afiada e iris transformar imediatamente na bomba (caudal: 8-10 ml / min). Continue perfusão até o fígado mostra uma cor café luz (~ 30 ml de HBSS). Ao longoa perfusão, cuidadosamente evitar qualquer formação de bolhas de ar na tubagem. Decapitar o rato com uma tesoura cirúrgica reta logo atrás do crânio. Use íris tesoura para fazer uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio. Coloque uma ponta da íris tesoura afiada para o forame magno e cortar lateralmente no crânio. Repetir para o outro lado. Use uma tesoura de íris afiados para cortar com cuidado a partir da mesma cavidade até a linha média para o nariz. Tente manter a extremidade da tesoura como superficial possível para evitar a lesão do cérebro. Use uma pinça fina para descascar delicadamente os ossos cranianos de cada hemisfério cerebral. Nota: tecido enfartado podem aderir às meninges ou o crânio; certifique-se de não perder tecido cerebral devido à dissecção incautious Levante o cérebro com uma espátula e usar a tesoura de íris afiadas para dissecar cuidadosamente fibras dos nervos cranianos que o fixam ao crânio. Colocar o cérebro para um tubo de 15 ml cheio com 10 ml de HBSS (+ Ca / Mg) e mantê-lo shortly em gelo. 4. A dissociação de tecidos cerebrais em suspensões de células individuais Remova cuidadosamente tronco cerebral e cerebelo com uma lâmina de barbear limpa. Use uma lâmina de barbear limpa para hemisect o cérebro e corte cada hemisfério ao longo do plano coronal em três peças de tamanho aproximadamente igual. Tritura dissecados de tecido de cada hemisfério através de um filtro de células de 100 um utilizando a extremidade de êmbolo de uma seringa de 5 ml. Continuamente lavar o filtro de células com HBSS arrefecida com gelo (+ Ca / Mg). Armazenar amostras homogeneizadas em gelo. Centrifugar a 286 xg e 4 ° C durante 5 min, cuidadosamente desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de digestão e transferir a suspensão para um tubo de 2 mL. Incubar a suspensão sob rotação contínua lenta a 37 ° C durante 1 h. suspensão de células crivo através de um filtro de células de 70 ^ m e enxaguar abundantemente com 3 ml de tampão de lavagem contendo ADNase, seguido por 15 ml de tampão de lavagem sem ADNase. Centrifugar a 286 xg e 18 ° C durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Nota: Nota: O uso de DNAse elimina muco DNA causado por lise celular que pode levar a agregação de células comprometer a sobrevivência da célula. 5. Densidade Gradiente centrifugação para remoção da mielina e restos celulares pellet celular Ressuspender em 5 ml de meio de gradiente de densidade de 25% e pipetar a suspensão para um tubo de 15 ml. Misturar bem por pipetagem repetida e suave evitando a formação de bolhas. Nota: meio de gradiente de densidade devem ser utilizados em RT para evitar aglomeração de células. Centrifugar a 521 xg e 18 ° C durante 20 min. Use menor perfil de aceleração do rotor e permite que o rotor parar sem travão. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem agitação. Aspirar cuidadosamente o revestimento de mielina e o sobrenadante enquanto preserva o sedimento de células na parte inferior do tubo. Nota: Certifique-se de remover todo o revestimento de mielina como qualquer sobra vai impair análise de citometria de fluxo. Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de lavagem livre de DNAse e pipetar a suspensão para um novo tubo de 15 ml. Nota: Este passo de lavagem é crucial uma vez que a remoção suficiente de meio de gradiente de densidade contribui significativamente para a quantidade e a qualidade da amostra de células final. Centrifugar novamente a 286 x g e 10 ° C durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de lavagem frio e determinar as contagens de células e a viabilidade por exclusão com azul tripano num hemocitómetro. Armazene as amostras a 4 ° C e ainda processá-los rapidamente. 6. Coloração de anticorpos para Análise de Citometria de Fluxo Antes da marcação com anticorpos, incubar a suspensão de células a 4 ° C durante 10 min com anti-CD16 de murino / reagente de bloqueio CD32 receptor Fc (concentração final de 2,5 ug / ml, factor de diluição 1: 200) para impedir a ligação não específica. Adicionar anticorpos primários fluoróforos no umconcentração ppropriate (como indicado na Tabela 1) à suspensão de células e incubar a 4 ° C durante 20 min no escuro. Nota: As amostras de controlo não são coradas com anticorpos primários, mas de outra forma tratados da mesma forma. Lavar as células com 2 ml de tampão de FC e centrifugar a 350 xg e 10 ° C durante 7 min.Carefully aspirar o sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 200 ul de tampão de FC. Armazenar as amostras temporariamente a 4 ° C no escuro até serem analisadas por citometria de fluxo. 7. Quantificação Absolute por colares de contas Inversamente pipeta 40 ul de tampão de FC e 10 ul da suspensão de células para um tubo de contagem, contendo um número conhecido de partículas fluorescentes. Nota: Preste atenção que as pipetas são calibradas para entregar exatamente 10 ul de amostra como posterior cálculo da contagem de leucócitos se refere a esse volume. Incubar suspensão de células com o anticorpo CD45 marcado com FITC (concentração finalde 5 ug / ml, factor de diluição 1: 100) a 4 ° C durante 20 min no escuro. Inversamente encher o tubo de contagem com 200 ul de tampão de FC, sem qualquer passo de lavagem e gravar directamente células CD45 + no citómetro de fluxo. 8. Aquisição de citometria de fluxo Nota: Para analisar o painel de anticorpos proposto, o citômetro apropriada tem de ser equipado com um azul (488 nm), vermelho (635 nm) e violeta (405 nm) laser e filtros para FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 e AmCyan. Ajuste para a frente (FSC) e sideward dispersão (SSC) usando células não coradas de um hemisfério isquêmico. Discriminar dobletes de células individuais em um gráfico de pontos mostrando a área e altura do FSC. Exibir todas as células individuais em histogramas de parâmetro único para cada canal de fluorescência usado e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT) tensões de modo que as células individuais são exibidos na extrema esquerda do histograma. Use um CD45-FITC únicaamostra corada para verificar as configurações de dispersão e PMT para as células de interesse por backgating células imunes altas CD45 em cada parcela histograma e de dispersão. Nota: Adaptar as voltagens de PMT de FITC para que CD45 negativo intermédio (int), e as células que expressam elevados podem ser diferenciados uns dos outros. Use anticorpo capturado esferas de compensação para executar a compensação multi-color. Definir portas para microglia (CD45 int) e leucócitos (CD45 alta) e, posteriormente, definir subpopulações de leucócitos de acordo com a estratégia de gating exibido na Figura 1.

Representative Results

A isquemia cerebral foi iniciado em 12 semanas de idade do sexo masculino ratinhos C57BL / 6 por meio de filamentos oclusão transiente da artéria cerebral média esquerda (MCAO). Para operação simulada o filamento foi inserido para obstruir a artéria cerebral média esquerda imediatamente retirada e para permitir a reperfusão instantânea. Importante, neuroinflamação celular difere substancialmente entre os comumente utilizados modelos de acidente vascular cerebral 19. Isso tem que ser mantido em mente especialmente quando extrapolar as descobertas de estudos com animais para a fisiopatologia heterogêneo de acidente vascular cerebral humano. Os ratinhos foram sacrificados 24 horas após MCAO para analisar a invasão de células imunes cedo para o cérebro isquémico. As contagens de células obtidas a partir do hemisfério isquémico (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) após centrifugação em gradiente de densidade foram comparáveis ​​aos do hemisfério contralateral (MCAO contrapartes; 1,09 ± 0,30 x 10E6) e ipsilateralhemisfério de ratos operados por simulação (ipsi sham; 1,12 ± 0,18 x 10E6, one-way ANOVA, p = 0,524). Viabilidade das células isoladas medido por exclusão de azul tripano foi elevada e não diferiram significativamente entre os grupos (sham 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, MCAO ipsi 95,68 ± 2,04%, one-way-ANOVA, p = 0,253 ). A composição do cérebro infiltrar 24 horas após MCAO foi determinada por análise de citometria de fluxo. A Figura 1 ilustra esquematicamente a estratégia de propagação (A) e acidente vascular cerebral em um animal representativo (B). Leucócitos infiltrantes cerebrais foram definidos como células de alta CD45 que podem ser diferenciados dos microglia CD45 int. Dentro da população elevada de CD45, neutrófilos polimorfonucleares (PMN) foram identificados por expressão de Ly-6G, enquanto os linfócitos T foram delineados como CD45 + CD3 alta células. As restantes células foram então elevados CD45 distinguired por CD19 (linfócitos B) e expressão de CD11b. A fração CD11b + foi ainda subcategorizados em Ly-6C alta `monocytes` inflamatória e uma Ly-6C população de baixa que engloba monócitos, células dendríticas (DC) e macrófagos. Na fase aguda do AVC, células do sistema imunológico mielóides dominar o cérebro se infiltrar 3,20. Neutrófilos entrar no cérebro rapidamente após a oclusão do vaso e promover o extravasamento de monócitos inflamatórios 21. Figura 2A mostra o aumento percentual de Ly6-G neutrófilos + na isquêmica do hemisfério cerebral de 24 horas após MCAO em comparação com o hemisfério e sham cirurgia contralateral. Em contrapartida, a proporção de células T CD3 + no hemisfério isquémico é (relativamente) mais baixa do que no cérebro saudável. Dentro da população de CD11b +, isquemia cerebral desloca o equilíbrio para uma forte predominância de Ly-6C elevados monócitos inflamatórios (Figura2B). Além disso a distribuição relativa, tubos de contagem foram usadas para determinar os números absolutos de subconjuntos de células imunitárias em amostras com base nos eventos CD45 positivos (Figura 3). tubos de contagem contém uma pelete liofilizada que liberta um número conhecido de partículas fluorescentes. O número absoluto de células positivas na amostra pode ser determinada relacionando eventos celulares a talão eventos. Para calcular o número de altas leucócitos CD45 per hemisfério foi utilizada a seguinte equação: altas células CD45 por hemisfério = (CD45 altas eventos x contas de contagem / eventos amostra talão total) x (volume suspensão total (100 mL) / volume da amostra (10 ul )). 24 horas após a MCAO, as contagens de leucócitos totais no hemisfério enfarte foram significativamente aumentados em comparação com o hemisfério contralateral e sham cirurgia (Figura 3D, ANOVA de uma via, p = 0,0004). Contagens do di subconjuntos de células imunitárias stinct (PMN, células-T, células-B, Ly-6C alta e baixa Ly-6C monócitos) pode ser facilmente calculado multiplicando a sua frequência relativa com o número total de leucócitos CD45 alta da respectiva amostra. Figura 1. Estratégia Gating para citometria de fluxo. (A) Ilustração esquemática da estratégia de gating. (B) mostra a análise de citometria de fluxo de leucócitos isolados a partir de um representante do cérebro de rato 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média. FSC dispersão para a frente, PMN neutrófilos, células dendríticas CDC clássicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/> Figura 2. Diferenciação de subconjuntos de células imunitárias. Distribuição relativa de Ly-6G + -neutrophils (A), células T CD3 + de (a) e subgrupos de monócitos identificados por expressão diferencial de Ly-6C (B) no ipsilateral (ipsi) e contralateral ( contra) hemisfério 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO) ou um respectivo cirurgia simulada. Percentagem de cada população é indicado no portão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. A quantificação do cérebro de leucócitos por contagem de grânulos. (A) mostra o portão grânulo altamente positiva dupla. Dentro da população de célula única (B) microglia CD45 int podem ser diferenciados a partir de leucócitos elevados de CD45 (C). Para a quantificação, o número de eventos de alta CD45 fechado foi normalizada para os acontecimentos contados grânulo. Note-se que total de leucócitos (CD45) elevadas contagens são significativamente aumentados no (ipsi) hemisfério ipsilateral contralateral em relação ao (contra) hemisfério e sham cirurgia de 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 por ANOVA one-way e Tukey`s post hoc teste de comparações múltiplas. n = 4-6 por grupo. FSC dispersão para a frente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. fluorocromo FITC PE PerCP PC7 <td rowpalmo = "2"> APC-Cy7 V500 (Cy5.5) antígeno CD45.2 CD3 Ly-6G CD19 Ly-6C CD11b A concentração final de [ig / ml] 5 1 0,2 0,2 1 1 factor de diluição 1/100 1/200 1 / 1.000 1 / 1.000 1/200 1/200 Clone 104 145-2C11 1A8 6D5 AL-21 M1 / 70 Tabela 1. Cocktail Básico Antibody para Immune Identificação celular na isquêmico cerebral.

Discussion

Aqui, nós descrevemos um método simples e eficaz para o isolamento de leucócitos do cérebro de murídeo após acidente vascular cerebral experimental. A abordagem produz de forma fiável a contagem de células altamente reprodutíveis por hemisfério cerebral permitindo medir painéis de fluxo diferentes, em uma réplica biológica.

Aparentemente, uma remoção incompleta das células imunitárias, incluindo o sangue vai resultar em uma visão distorcida na quantidade real de células inflamatórias que entrou no cérebro isquémico. Assim, ao utilizar este protocolo de prestar especial atenção à perfusão transcardial minuciosa para evitar a contaminação de células imunes infiltradas com leucócitos não-inflamatórias circulantes. A partir da experiência, o uso de agulhas grossas para punção do ventrículo esquerdo reduz o risco de lesão do septo interventricular, que seria ignorar perfusão da circulação sistêmica. Surgimento de fluido de perfusão das narinas é um sinal de que a perfusão pressureis demasiado elevado, assim, umacaudais nulos> 10 mL / min. Pálido a cor branca do tecido cerebral indica boa perfusão, enquanto cor rosada é um sinal de má perfusão.

Outro passo fundamental deste protocolo é a dissociação eficiente do tecido cerebral que compreende a fragmentação mecânica, bem como digestão enzimática. Picagem do tecido através do filtro de células é crítica para proporcionar uma melhor eficácia de proteases. No entanto, quando homogeneizar o tecido, evitar a pressão excessiva como fagócitos mononucleares são altamente suscetíveis a autólise 22. Para a digestão enzimática Liberase TL é recomendado que é uma mistura de colagenase I altamente purificado e II que contenham baixas concentrações de termolisina a protease neutra. A comparação direta com os protocolos de isolamento descritos anteriormente 14,22,23 reveladas significativamente maior de recuperação de células viáveis ​​por tratamento Liberase TL (km dados não publicados). Em comparação com colagenase, que é freqüentemente usamd para o isolamento de células do sistema imunológico do cérebro, Liberase TL contém níveis negligenciáveis ​​de endotoxina. Isto é de especial importância se as células são classificadas para análise a jusante porque níveis elevados de endotoxina pode mudar o estado de activação das células do sistema imunológico e 24 severamente prejudicar os resultados de cultura de células 25. Outra desvantagem da colagenase tradicional é significativas diferenças de lote para lote nas atividades enzimáticas que põe em risco a reprodutibilidade dos resultados e exige determinação da concentração de trabalho para cada lote 26.

No cérebro adulto, a remoção da mielina por centrifugação de gradiente de densidade é uma passo indispensável para aplicações a jusante, tais como citometria de fluxo ou mais estudos sobre gene ou expressão da proteína. Uma vantagem principal do protocolo é o procedimento a densidade de camada única que não requer preparação demorada de gradientes. Além disso, o protocolo de separação produz resultados fiáveiss mesmo quando realizado por pesquisadores em vez inexperientes. É desprovido de gradientes em camadas com densidades perto um do outro que são difíceis de pipeta, sem perturbar a interface entre os dois.

Com base na expressão do marcador de superfície CD45, o protocolo produz três categorias principais de células no cérebro isquémico. A grande maioria das células pertencem a uma população negativa para CD45 que é composta por células neuronais, astroglia, ependimal e células endoteliais. A sua presença abundante é atribuído ao gradiente de densidade de camada única, que visa principalmente a mielina eficiente e remoção de detritos. Além disso, uma população CD45 int representando microglia residentes 27 podem ser diferenciadas a partir de uma população elevada de CD45 que contém principalmente leucócitos de infiltração hematog�icas. No entanto, deve notar-se que a microglia activada pode adoptar o fenótipo e função de células mielóides do sangue nascido. Assim, apenas aplicando sofisticoud técnicas como parabiosis 28, medula óssea quimeras 29 ou análise de mapeamento destino 30 permitem uma distinção clara entre essas duas populações durante a inflamação.

A análise dos dados em citometria de fluxo é muitas vezes limitado à distribuição percentual das populações de células específicas. No entanto, quando se compara o enfarte hemisfério ao tecido cerebral não-infartada esta informação pode ser enganosa, porque não se considera a contagem total de leucócitos cérebro que são trocados por lesão isquêmica. Assim, para traçar um quadro completo sobre a magnitude e fenótipo de infiltrados inflamatórios após a distribuição relativa golpe de subconjuntos de células imunes devem ser complementadas por número absoluto de células. Ao utilizar microesferas, conforme descrito neste protocolo, pipetagem de um volume de amostra preciso é absolutamente obrigatório para obter resultados confiáveis. Além disso, pipetagem reversa é altamente recomendável para evitar a formação de espuma no tubo de contagem. Decorrente bolhas de arirá reduzir o volume esperado de microesferas e, consequentemente, levar a uma superestimação da absolutos CD45 alta contagem de leucócitos na amostra.

Em resumo, este protocolo prevê uma abordagem fácil e confiável para isolar células do sistema imunológico do cérebro. Ela pode servir como uma ferramenta valiosa para dissecar a complexidade da resposta inflamatória a acidente vascular cerebral isquêmico. futuras aplicações incluem investigações sobre o papel dependente do tempo de subgrupos de monócitos na propagação e resolução de inflamação cerebral isquêmico. Do mesmo modo, o papel do sistema imune adaptativo após acidente vascular cerebral é mal compreendida. Citometria de fluxo e subpopulações de células T identificados pela expressão de factores de transcrição ou citocinas específicas do subconjunto in situ pode ajudar a esclarecer o seu impacto na recuperação a longo prazo após o acidente vascular cerebral e caminhos promissores, assim, em aberto para o desenvolvimento de novas abordagens de tratamento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem Isabell Schulz para excelente suporte técnico.

Materials

Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel World precision instruments PERIPRO-4LS
Heracell 240i CO2 incubator  Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+ Thermo Scientific
FACS Canto II Becton Dickinson
Isoflurane Abbott 4831850
Hank's buffered salt solution (HBSS) Gibco/Life Technologies GmbH 14175-129
HBSS with Calcium/Magnesium Gibco/Life Technologies GmbH 24020-091
Liberase TL Roche Diagnostics GmbH 5401020001 use at room temperature
Percoll Plus GE Healthcare Europe GmbH 17-5445-01
Fetal bovine serum  PAN Biotech 3302-P101003
Trypan blue Gibco/Life Technologies GmbH 15250-061
Trucount BD Biosciences 340334
Phosphate buffered saline Biochrom AG L 182-10
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 11284932001
CD11b Horizon V500 BD Biosciences 562128
CD16/CD32 eBioscience 14-0161
CD45.2 FITC eBioscience 11-0454
CD3 PE Biolegend 100307
CD19 PE-Cy7 Biolegend 115519
Ly6C APC-Cy7 BD Biosciences 560596
Ly6G PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560602
Silicone Tubing, 1m World precision instruments 503022
Fine Iris Scissors sharp Fine Science Tools 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools 14130-17
Fine Iris Scissors sharp/blunt Fine Science Tools 14028-10
Straight 1×2 teeth forceps Fine Science Tools 11021-14
Blunt-end Forceps Fine Science Tools 11008-13
5ml syringe plunger Carl Roth GmbH (Braun) EP96.1
Cell strainer, 100µm Dr. I. Schubert, BD 2360-00
Omnican Fine dosage syringe 1ML Braun TBD
Cell strainer, 70µm Greiner Bio-One GmbH 542 070
FACS Tubes BD Bioscience GmbH 352052
serological pipettes, 10ml Greiner Bio-One GmbH 607180
serological pipettes, 10ml Sarstedt AG&Co 861,254,025
serological pipettes, 25ml Greiner Bio-One GmbH 760180
serological pipettes, 5ml Greiner Bio-One GmbH 606180
serological pipettes,25ml Sarstedt AG&Co 861,685,020
serological pipettes,5ml Sarstedt AG&Co 861,253,025
Tips, 0,1-10µl Corning B.V.Life Sciences 4840
Tips, 100-1000µl Greiner Bio-One GmbH 740290
Tips, 10-200µl Greiner Bio-One GmbH 739296
Reaction tubes 1,5ml Greiner Bio-One GmbH 616201
Reaction tubes 2ml Greiner Bio-One GmbH 623201
Bacteriological petri dish, 94x16mm Greiner Bio-One GmbH 633180
Falcon 15ml Greiner Bio-One GmbH 188271
Falcon 50ml VWR International GmbH (BD) 734-0448
Neubauer hemocytometer Biochrom AG PDHC-N01
razor blade Carl Roth GmbH CK07.1
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References

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Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (108), e53658, doi:10.3791/53658 (2016).
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