العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس
Summary
Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
Abstract
السكتة الدماغية تستهل الاستجابة الالتهابية قوية أن يبدأ في حجرة داخل الأوعية الدموية وينطوي على تفعيل السريع للخلايا المقيمين الدماغ. آلية رئيسية من هذه الاستجابة الالتهابية هي هجرة تعميم الخلايا المناعية إلى الدماغ الدماغية سهلت الإفراج chemokine وزيادة التعبير جزيء التصاق الخلايا البطانية. ومن المعروف جيدا كريات الدم البيضاء-غزو الدماغ المساهمة في مرحلة مبكرة الإصابة الدماغية الثانوية، ولكن تم مؤخرا لاحظت أهميتها لإنهاء الالتهاب وإصلاح الدماغ في وقت لاحق فقط.
هنا، يتم توفير بروتوكول بسيط للعزلة كفاءة الخلايا المناعية من مخ الفأر الدماغية. بعد نضح transcardial، يتم تشريح نصفي الدماغ وفصلها ميكانيكيا. ويتبع الهضم الأنزيمي مع Liberase من التدرج الكثافة (مثل Percoll) الطرد المركزي لإزالة المايلين والحطام الخلية. واحد الميزة الرئيسية لهذا ط بروتوكولق طبقة واحدة الإجراء التدرج الكثافة التي لا تتطلب وقتا طويلا إعداد التدرجات ويمكن أن يؤديها بشكل موثوق. النهج غلة عدد الخلايا استنساخه للغاية في نصف الكرة المخ ويسمح لقياس عدة لوحات التدفق الخلوي في تكرار البيولوجي واحدة. التوصيف المظهري وتقدير من الكريات البيض، تغزو المخ بعد السكتة الدماغية التجريبية يمكن أن تسهم في فهم أفضل لأدوار متعددة الأوجه في الإصابة الدماغية والإصلاح.
Introduction
السكتة الدماغية الدماغية يتسبب في الاستجابة الالتهابية المتواصلة التي تبدأ بسرعة بعد وقف تدفق الدم المحلي ويشمل تقريبا جميع أجزاء من الجهاز المناعي. واحدة سمة هامة من هذه الاستجابة الالتهابية هي تدفق الوقت المناسب من الخلايا المناعية إلى الدماغ الذي يحركه تنشيط الخلايا البطانية الدماغ، إفراز chemokine كبير وزيادة تدفق متعاطفة 1-3. اعتبر تسلل خلية التهابات سابقا ضارة في السكتة الدماغية، ومع ذلك، فشلت عدة محاكمات العلاج يهدف إلى منع عشوائيا الكريات البيض الخروج إلى الدماغ للحث على فائدة سريرية قابلة للقياس (4). وفي الآونة الأخيرة، أصبح واضحا أن الخلايا المشتقة من الوحيدات تشترك في بادئ الأمر في تطور الضرر نقص تروية 5 قد تلعب أيضا دورا محوريا لقرار من التهاب الأنسجة واللاحقة إصلاح 6.
بفضل تحديد المظهرية وfunctiعدم التجانس بين اونال وحيدات الضامة، وسعت بشكل كبير من المعرفة حول دور البالعات وحيدات النوى في التنمية وحل التهاب. في الفئران، وحيدات تعميم يمكن تصنيفها إلى قسمين على الأقل فرعية متميزة وظيفيا وفقا لتعبير سطحها من اللمفاويات مستضد 6 مجمع (لي-6C) 7. في حين كانت لي-6C monocytes''inflammatory عالية يظهر ذلك بوضوح على أنها ضرورية لمكافحة الالتهابات البكتيرية 8، ودورها في الإصابة العقيمة هو أكثر إثارة للجدل. في السكتة الدماغية، أدى الاجتثاث الانتقائي للحيدات عالية CCR2 + لي-6C في النزفية احتشاء التحول 6. ومع ذلك، تحسنت المنهج التجريبي نفس الإعاقة الحادة بعد نزيف داخل المخ 9. وبالمثل، يعتقد أن مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T لممارسة إما ضارة 10 أو وقائية الإجراءات 11 في إصابات الدماغ الدماغية، ومع ذلك، البيانات controversiآل 12،13 ومذكرات مزيد من التحقيقات. ونظرا لهذا التعقيد المتزايد، يصبح من الواضح أن تعميق معرفة دور كل من الخلايا المناعية المتنوعة في الإصابة الدماغية وإصلاح أمر حاسم لترجمة النتائج التجريبية في العلاجات التي تستهدف التهاب آخر السكتة الدماغية.
اليوم، أقوى أداة لتحليل الاستجابات المناعية الخلوية متعدد الألوان التدفق الخلوي. وهو يتيح للتحديد وتقدير من مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية في موقع الالتهاب دون الحاجة إلى انحياز النظام في الجسم الحي العلامات أو التلاعب الجيني 14. تلطيخ وقت واحد من علامات سطح الخلية مع الأجسام المضادة ضد السيتوكينات داخل الخلايا 15 أو النسخ عوامل 16 بالإضافة إلى ذلك يوفر معلومات حول حالة الوظيفية الفردية خلايا، حدد ظاهريا. كما عيب رئيسي واحد، يطلب تعليق خلية واحدة لفحوصات تدفق cytometric، وبالتالي حصول على معلومات حول الموضعيتم فقدان alization من تتسرب الخلوية. ومع ذلك، في حين أن الأنسجة مثالية للحصول على معلومات المكانية، ويقتصر من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لوصف أنواع فرعية الخلايا المناعية في أنسجة معينة. اليوم، هناك حاجة إلى الجمع بين وجود وعدم وجود علامات سطح مختلفة لتحديد بشكل لا لبس فيه نادرة فرعية الخلايا المناعية، وخاصة متميزة السكان خلية الوحيدات المستمدة أثناء التهاب 17.
هنا، نحن تصف بروتوكول كفاءة لعزل أعداد كبيرة من الكريات البيض من مخ الفأر تال للإقفار باستخدام بسيط طبقة واحدة التدرج الكثافة. تعليق خلية تم الحصول عليها يمكن أن يكون إما عن طريق تحليل تدفق متعدد الأبعاد الخلوي أو مزيد من إثراء فرز تدفق cytometric أو اختيار immunomagnetic لإجراء تحليلات المصب محددة للغاية. تفاصيل طريقة نضح transcardial، وإزالة نصفي الدماغ، تفكك الأنسجة الدماغية في المعل خلية واحدةensions، والكثافة الطرد المركزي التدرج لإزالة النخاعين وكذلك تلوين الأجسام المضادة لتحليل تدفق cytometric.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف طريقة بسيطة وفعالة لعزل الكريات البيضاء من الدماغ الفئران بعد السكتة الدماغية التجريبية. النهج غلة موثوق عدد الخلايا استنساخه للغاية في نصف الكرة المخ مما يسمح لقياس تدفق وحات مختلفة في تكرار البيولوجي واحدة.
على ما يبدو، وعلى إزالة غير كاملة من الدم بما في ذلك الخلايا المناعية تؤدي إلى النظرة المشوهة على المبلغ الفعلي من الخلايا الالتهابية التي دخلت الدماغ الدماغية. وهكذا، عند استخدام هذا البروتوكول إيلاء اهتمام خاص لنضح transcardial شامل لمنع التلوث من الخلايا المناعية تسلل مع الكريات البيض غير التهابية المتداولة. من الخبرة، واستخدام الإبر حادة لالأيسر ثقب البطين يقلل من خطر إصابة الحاجز بين البطينين التي من شأنها تجاوز نضح من الدورة الدموية. ظهور السائل نضح من فتحتي الأنف هو علامة على أن نضح pressureis مرتفعة للغاية، وبالتالي، لمعدلات تدفق باطلة> 10 مل / دقيقة. شاحب للون الأبيض من أنسجة المخ يشير نضح جيد في حين ردي اللون هو علامة ضعف التروية.
خطوة أخرى حاسمة من هذا البروتوكول هو التفكك الفعال للأنسجة المخ والتي تضم تجزئة الميكانيكية وكذلك الهضم الأنزيمي. تنميق الأنسجة من خلال مصفاة الخلية أمر بالغ الأهمية لتوفير وتحسين فعالية البروتياز. ومع ذلك، عندما المجانسة الأنسجة، وتجنب الضغط المفرط كما البالعات وحيدات النوى هي عرضة للانحلال ذاتي 22. لعملية الهضم الأنزيمي Liberase TL ينصح التي هي مزيج من نظافة كولاجيناز الأول والثاني يحتوي على تركيزات منخفضة من thermolysin البروتيني محايدة. المقارنة المباشرة مع بروتوكولات العزلة التي سبق وصفها 14،22،23 كشف الانتعاش أعلى بكثير من خلايا قابلة للحياة عن طريق العلاج Liberase TL (KM بيانات غير منشورة). مقارنة كولاجيناز وهي كثيرا ما تستخدمد لعزل الخلايا المناعية من الدماغ، Liberase TL يحتوي على مستويات ضئيلة من الذيفان الداخلي. ولهذا الأمر أهمية خاصة إذا كان يتم فرز الخلايا لتحليل المصب لمستويات عالية من الذيفان الداخلي قد تغيير حالة تنشيط الخلايا المناعية 24 وبشدة يضعف زراعة الخلايا نتائجها 25. عيب آخر من كولاجيناز التقليدية غير هامة الاختلافات الكثير إلى الكثير في أنشطة الانزيم الذي يعرض للخطر استنساخ نتائج ويتطلب تحديد تركيز العمل لكل دفعة 26.
في الدماغ الكبار، وإزالة المايلين بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج خطوة لا غنى عنها لتطبيقات المصب مثل التدفق الخلوي أو إجراء المزيد من الدراسات على الجين أو البروتين التعبير. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هو الإجراء كثافة طبقة واحدة والتي لا تتطلب وقتا طويلا إعداد التدرجات. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول الفصل تنتج نتيجة موثوقةق حتى عندما يقوم بها المجربون عديم الخبرة إلى حد ما. وهي خالية من التدرجات الطبقات ذات الكثافة قريبة من بعضها البعض التي يصعب ماصة دون إزعاج واجهة بينهما.
واستنادا إلى التعبير عن سطح علامة CD45، بروتوكول غلة ثلاث فئات رئيسية خلية في الدماغ الدماغية. الغالبية العظمى من خلايا تنتمي إلى CD45 السكان السلبية التي تتكون من الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا، البطانة العصبية والخلايا البطانية. ويعزى السبب في وجود وفرة في التدرج كثافة طبقة واحدة والتي تهدف في المقام الأول إلى المايلين كفاءة وإزالة الأنقاض. بالإضافة إلى ذلك، يبلغ عدد سكانها CD45 كثافة العمليات تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة 27 يمكن أن تكون متباينة من السكان CD45 العالية التي يحتوي أساسا التسلل الكريات البيض دموية المنشأ. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة قد تعتمد النمط الظاهري ووظيفة خلايا الدم النخاعي المولد الدم. وهكذا، المحنك فقط تطبيقتقنيات د مثل تعايش التصاقي 28، ونخاع العظام الوهم 29 أو تحليل الخرائط مصير 30 يسمح للتمييز واضح بين هؤلاء السكان اثنين أثناء الالتهاب.
تحليل البيانات في التدفق الخلوي غالبا ما يقتصر على التوزيع النسبي للسكان خلية معينة. ومع ذلك، عند مقارنة احتشاء نصف الكرة إلى أنسجة المخ غير محتشية هذه المعلومات يمكن أن تكون مضللة لأنها لا تعتبر العدد الكلى الكريات البيض الدماغ التي يتم تغييرها من قبل الإصابة الدماغية. وهكذا، لرسم صورة كاملة عن حجم والنمط الظاهري للتتسرب التهابات بعد ويجب أن يستكمل توزيع السكتة الدماغية النسبي للمجموعات فرعية الخلايا المناعية التي كتبها أعداد الخلايا المطلقة. عند استخدام ميكروبيدات كما هو موضح في هذا البروتوكول، pipetting لمن حجم عينة دقيق إلزامي على الاطلاق للحصول على نتائج موثوقة. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن pipetting لعكس بقوة لتجنب تشكيل رغوة في أنبوب العد. الناشئة فقاعات الهواءسوف يقلل من الحجم المتوقع من ميكروبيدات، وبالتالي يؤدي إلى المبالغة في تقدير المطلقة CD45 التهم ارتفاع الكريات البيض في العينة.
وباختصار، يوفر هذا البروتوكول نهج سهلة وموثوقة لعزل الخلايا المناعية من الدماغ. قد يكون بمثابة أداة قيمة لتشريح تعقيد الاستجابة الالتهابية للسكتة الدماغية. وتشمل التطبيقات المستقبلية التحقيقات حول دور تعتمد على الوقت من مجموعات فرعية الوحيدات في نشر وقرار من التهاب الدماغ الدماغية. وبالمثل، فإن مفهومة دور الجهاز المناعي التكيفي بعد السكتة الدماغية. تحليل تدفق cytometric من القطعان الخلايا التائية التي حددها تعبير عن عوامل النسخ-فرعية معينة أو السيتوكينات في الموقع قد تساعد على توضيح تأثيرها على التعافي على المدى الطويل بعد السكتة الدماغية وآفاقا واعدة وبالتالي مفتوحة لتطوير أساليب علاجية جديدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر إيزابيل شولتز حصول على الدعم الفني الممتاز.
Materials
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
- Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
- Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -. C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
- Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D’Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
- Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
- Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
- Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
- Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
- Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
- Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
- Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
- Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -. C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., Coligan, J. E. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. , (2007).
- Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, 377-390 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Wagner, D. -. C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
- Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), 34-44 (2013).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
- Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), 2996-3004 (1950).
- Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
- McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), 4309-4321 (1950).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. a. b. i. o. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
