طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Summary
هنا، نحن تصف طريقة لتنقية الخلايا الجنينية البشرية المتباينة الجذعية التي ترتكب نحو الأديم الباطن نهائي لتحسين التطبيقات المصب ومزيد من التفرقة.
Abstract
قدرات تمايز الخلايا الجذعية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) تسمح لتطبيق العلاجية المحتملة للعلاج استبدال الخلية. الميؤوس من شفائهم يمكن أن تستخدم أنواع الخلايا المتمايزة لعلاج العديد من الأمراض التنكسية. في المختبر التفريق بين هذه الخلايا نحو أنسجة الرئة والكبد والبنكرياس يتطلب كخطوة أولى توليد خلايا الأديم الباطن نهائية. هذه الخطوة من أجل مزيد من التمايز نحو أنواع الخلايا نضجت عضال مثل خلايا بيتا المنتجة للأنسولين، خلايا الكبد أو غيرها من أنواع الخلايا المشتقة الأديم معدل الحد. الخلايا التي ملتزمون تجاه السلالة الأديم تعبر عن درجة عالية من العديد من عوامل النسخ مثل FOXA2، SOX17، HNF1B، وأعضاء الأسرة غاتا، ومستقبلات سطح CXCR4. ومع ذلك، بروتوكولات التفريق نادرا فعالة 100٪. هنا، نحن تصف طريقة لتنقية سكان الخلية CXCR4 + بعد المفاضلةفي دي باستخدام ميكروبيدات المغناطيسية. هذا بالإضافة إلى تنقية يزيل خلايا الأنساب غير المرغوب فيها. طريقة تنقية لطيف سريع وموثوق بها ويمكن أن تستخدم لتحسين التطبيقات المصب والتفرقة.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) لديها القدرة على التمايز إلى تقريبا أي نوع من الخلايا في الجسم البشري. وهكذا، في المختبر بروتوكولات التمايز يمكن استخدامها لتوليد العديد من أنواع الخلايا الكبار مثل العضلية 1، 2 خلايا الكبد، وخلايا بيتا 3، الظهارية الرئة 4 أو الخلايا العصبية 5. وهذا يجعل المجالس الاقتصادية والاجتماعية أداة قيمة لعلاج المحتملة لمختلف الأمراض التنكسية 3.
التمايز في المختبر من المجالس الاقتصادية والاجتماعية نحو أنسجة البالغين في الرئة والكبد والبنكرياس يتطلب الزائفة تكون المعيدة إلى خلايا تشبه الأديم الباطن نهائي (DE) 6. منذ التمايز المصب نحو أنواع الخلايا الجسدية المذكورة أعلاه بشكل ملحوظ أقل كفاءة، ويعتبر أحد التمايز الأديم الباطن على النحو الأمثل معدل الحد 7. الخلايا التي ملتزمون تجاه السلالة الأديم الباطن تخضع تشاالتغييرات racteristic في التشكيل التعبير الجيني بهم. وأسفل تنظيم الجينات منظم تعدد القدرات الرئيسية، في حين أن التعبير عن عوامل النسخ الأخرى مثل FOXA2، SOX17، HNF1B، وأعضاء الأسرة GATA ومستقبلات سطح CXCR4 وupregulated للغاية 6، 8، ومن المعروف 9. CXCR4 أن transactivated التي كتبها SMAD2 / 3، المصب العقدية الإشارات / TGF-β وSOX17 بسبب مواقع محددة ملزمة في منطقة المروج لها (10). وهكذا هو علامة مناسبة جدا تستخدم في عدد من التقارير 6، 8، 11-13. هذه التغييرات التعبير يعكس حالة شبه تكون المعيدة، الذي المجالس الاقتصادية والاجتماعية أولا اكتساب خصائص بدائية سكان الخلية مثل خط والالتزام بعد ذلك إلى الأديم الجرثومية طبقة 6.
ومع ذلك، بروتوكولات التفريق نادرا 100٪ كفاءة عن عدد قليل من الخلايا قد تقاوم عملية التمايز أو التفريق نحو الأنساب أخرى غير مقصودة 14. هذه الخلايا قد لحالات الإنفلونزا سلبامزيد من التمايز NCE. وعلاوة على ذلك، خلايا غير متمايزة المتبقية تؤوي مخاطر كبيرة لاجراء تجارب زرع وقت لاحق وربما تؤدي إلى مسخي المبيض 15-17.
لإزالة هذه الخلايا غير المرغوب فيها في وقت مبكر على السطح علامة CXCR4 يمكن أن تستخدم لتنقية الخلايا التي ملتزمون تجاه DE 18. هنا، نحن تصف طريقة لاختيار إيجابية من CXCR4 + الخلايا من الثقافات التمايز DE. لهذا، لا بد من علامة CXCR4 السطح بواسطة الأجسام المضادة التي ثم بدوره يربط ميكروبيدات المغناطيسية. وخلافا لظروف قاسية خلال FACS الفرز، والخلايا DE مثل المسمى مغناطيسيا يمكن بعد ذلك بسهولة يمكن تنقيته في شكل الفوق باستخدام طريقة تنقية لطيف. يوفر هذا البروتوكول طريقة واضحة لإزالة السكان الخلية التي قاومت عملية التمايز DE.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكولات التمايز المستخدمة حاليا نادرا ما يؤدي إلى خلايا متمايزة 100٪. وذلك لأسباب لا تزال بحاجة الى معالجة بعض الخلايا تقاوم عملية التمايز. اعتمادا على كفاءة بروتوكول التمايز المستخدمة والميل للESC خط لوحظ عدد معين من الخلايا المحفزة المتبقية عادة حتى بعد التمايز إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
واعترف بالمساعدة التقنية الماهرة من ياسمين Kresse العرفان.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536 (2011).
