ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.
Abstract
פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע כמוני, תא בודד באתרו מנתח של ביטוי חלבון ללמוד מפרט שושלת בעוברי preimplantation עכבר. הנהלים הדרושים אוסף העובר, immunofluorescence, הדמיה על מיקרוסקופ confocal, ופילוח תמונה וניתוח מתוארים. שיטה זו מאפשר לכמת את הביטוי של סמנים גרעיניים מרובים ואת מרחבית (XYZ) קואורדינטות של כל תאים בעובר. הוא מנצל MINS, כלי תוכנה פילוח תמונה שפותחו במיוחד עבור ניתוח של תמונות confocal של עוברים preimplantation ואת תאי גזע עובריים מושבות (ESC). MINS מבצעת פילוח גרעיני ללא פיקוח ברחבי ממדי X, Y ו- Z, ומייצרת מידע על מצבת תא בחלל תלת ממדים, כמו גם רמות קרינה גרעינית עבור כל ערוצים עם קלט משתמש מינימאלי. בעוד פרוטוקול זה בצורה מיטבית עבור הניתוח של תמונותשל עוברי עכברים בשלב preimplantation, זה יכול בקלות להיות מותאם הניתוח של כל דוגמאות אחרות מפגינות יחס אות לרעש טוב ואיפה צפיפות גרעינית גבוהה מציבה משוכה פילוח תמונה (לדוגמא., ניתוח ביטוי של תאי גזע עובריים (ESC מושבות), הבחנת תאים בתרבית, עוברים של מינים אחרים או בשלבים, וכו ').
Introduction
עובר preimplantation העכבר הוא פרדיגמה ללמוד את הופעתה ותחזוקה של pluripotency in vivo, כמו גם מודל לחקר מפרט גורל תא דה נובו epithelialization ביונקים. שלבי preimplantation של פיתוח יונקים מוקדשים הקמת שלוש שושלות התאים שמרכיבים את הבלסטוציסט, כלומר epiblast פלוריפוטנטיים – אשר מוליד את רוב הרקמות סומטיים בתאים ניבט – ושתי שושלות extraembryonic, את trophectoderm (TE) ואת endoderm פרימיטיבי (PRE) (איור 1 א) 1,2. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים (1) הקציר ולתקן עוברי עכברים בשלב preimplantation, (2) לבצע immunofluorescence לתייג חלבונים בעלי עניין, (3) לבצע כל הר הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם יכולות חתך-z ו- (4) לבצע פילוח הגרעין של תמונות confocal ומנתח תמונה כמותית שלאחר מכן. צינור זה מאפשר tהוא משוחד מדידת רמות החלבון בגין המחאת זהויות תא לאפיין תת-אוכלוסיות של תאים באתרו. פרוטוקול זה יכול להתבצע בתוך זמן קצר של 3 – 4 ימים עבור המלטה אחת (בדרך כלל עד 10 עוברי עכברים), מאוסף העובר בניתוח הנתונים (איור 1B). הניתוח סימולטני של המלטות כמה יגדיל את ניתוח ההדמיה ונתונים נטלו הזמן, ובכך להאריך את אורכו הכולל של פרוטוקול.
עובר העכבר הבמה preimplantation הוא מערכת צייתנית באופן ניסיוני אשר, בהינתן גודלו הקטן וסטריאוטיפית מורפולוגיה 3, הוא גם מתאים בתחום הדמית טוטו של תהליכים תאיים עם רזולוצית תא בודד. כדי לבצע ניתוח משוחד, מערכות ברמה של מספר סטטיסטית הרלוונטי של עוברים, אוטומטית, צינור ניתוח כמוני רצוי. עם זאת, בשל צפיפות גרעיני גבוה של מסת התאים הפנימית (ICM) של הבלסטוציסט ( <stרונג> האיור 1A, 2D), פלטפורמות פילוח תמונה מקובלת אינו מספק מספיק דיוק להקים זרימת עבודה אוטומטי או חצי אוטומטי. מצד שני, פילוח ידני, בעוד מדויק, אינו מאפשר העיבוד של קבוצות גדולות של תאי עוברים, וגם לא מתאים להגדרה לשחזור, משוחדת של זהויות תא – שהוא קריטי במיוחד כאשר לומד שלבי התפתחות, שהדפוסים של סמן ביטוי לא נפתר במלואה (למשל, אינה מציג חלוקה בינארית פני אוכלוסייה). פתחנו לאחרונה ומאומתים שיטת פילוח תמונה מותאמת בעוברי העכבר preimplantation ועבור תאי גזע עובריים בעכבר (ESCs) המשיג דיוק גבוה, תוך דורשי השקעת משתמש מינימאלי 4-8.
צינור הניתוח שמובא כאן סובב סביב כלי הפילוח המבוסס תמונת MATLAB הפילוח הגרעיני האינטרקטיווי מודולרי (דקות) 4. MINS performs פילוח גרעיני ללא פיקוח על קבוצות גדולות של ערימות-Z confocal לאחר שמשתמש קימת מספר מינימאלי של מאפייני תמונה, באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) (טבלה 1) 4. צינור זה הוכיח עצמו יעיל עבור דור של נתוני העברת נתונים גבוהים על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא סוג שני בר, מטופלים בניסוי וגנטי עוברת משונה ESCs 5-7. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את היישום של דקות עד פילוח תמונות העובר preimplantation הבמה. לדוגמאות של ביצועים MINS על ESCs עיין 4,7. הצעד פילוח גרעיני אוטומטי מפחית באופן משמעותי את נטל הזמן של תהליך זיהוי התא, ואילו מדידות עוצמת מרחבית הקרינה לאפשר קביעה משוחדת של זהויות התא לבין הדור של מפות תלת-ממדיות של תחומים ביטוי גנים בעמדה תא בעובר (איור 1C </strong>). יתר על כן, את יכולת ההרחבה של זרימת העבודה זו עושה את זה החלות על הניתוח של המלטות פרט באמצעות קבוצות גדולות של עוברי מטופלים באופן ניסיוני, או עוברי של רקע גנטי שונה 5,6. MINS זמין באופן חופשי http://katlab-tools.org (התוכנה דורשת רישיון MATLAB).
אין גישה שפותחה עד היום מאפשר הדור של נתונים מעמיקים כזה על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא עוברי preimplantation העכבר. כל הניסיונות עד כה ב לכימות סוגים אלה של נתונים הוגבלו על נחישות quantitation ידני של מספרים סלולריים עבור אוכלוסיות שונות בעובר (או לגמרי באופן ידני, או תוכנה בסיוע) 9-19. הגישה זו (שילוב תוכנה דקה) כבר מותאמת ונבדקה על עוברי preimplantation עכבר ESCs; זאת ביצועיו על מערכות אחרות עם צפיפות גבוהה גרעינית, למרות עדיין נבדק, צפויים להיות שווה ערך.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבצע ניתוח כמותי של immunofluorescence כל הר על עוברי עכברים בשלב preimplantation. פרוטוקול immunofluorescence חזק 22 ואחריו ברזולוציה גבוהה, כל הר הדמית confocal ועל ידי פילוח תמונה באמצעות פיסת מחויטת של תוכנת 4. בעוד הבחירה של פרוטוקול immunofluorescence אינה קריט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
