CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

Des éléments de régulation transcriptionnelle sont critiques pour réglage fin spatio-temporelle de l' expression des gènes au cours du développement ¹ et la modification de ces éléments peut entraîner une maladie due à l' expression génique aberrante ^2. De nombreuses régions associées à des maladies identifiées par le génome des études d'association sont larges dans les régions non codantes et présentent des caractéristiques d'amplificateurs de transcription ^3-4. L' identification des amplificateurs et les harmoniser avec les gènes qu'ils régulent est compliqué car ils sont souvent situés à plusieurs kilobases à l' écart des gènes qu'ils régulent et peuvent être activées d'une manière spécifique au tissu ^5-6. Prévisions Enhancer sont généralement basées sur des marques de modification des histones, des complexes de médiateur-cohesin et la liaison de la cellule transcription spécifique de type facteurs ^7-10. La validation des amplificateurs de prédits est le plus souvent réalisé par un dosage à base de vecteur dans lequel l'activateur active l' expression d'un gène rapporteur ^11-12. Ces données fournissent vinformations ressources précieuses sur le potentiel de régulation des séquences amplificatrices putatives, mais ne révèlent pas leur fonction dans leur contexte génomique endogène ou d'identifier les gènes qu'ils régulent. édition du génome est un outil puissant pour étudier la fonction des éléments de régulation transcriptionnelle dans leur contexte endogène par l'analyse de perte de fonction.

Les progrès récents dans l'édition du génome, à savoir le / cas9 système de montage du génome CRISPR, faciliter l'enquête de la fonction du génome. Le système / cas9 CRISPR est facile à utiliser et adaptable à de nombreux systèmes biologiques. La protéine cas9 est ciblé à un site spécifique par une ARN de guidage (ARNg) ¹³ dans le génome. Le complexe SpCas9 / gARN analyse du génome pour sa séquence génomique cible qui doit être 5 'à une séquence protospacer motif adjacent (PAM), NGG ^14-15. Appariement de bases de l'ARNg à sa cible, un 20 nucleotides (nt) la séquence complémentaire de l'ARNg, active une activité nuclease SpCas9 résultant en un doublpause e brin (DSB) de 3 pb en amont de la séquence PAM. La spécificité est obtenue par appariement complet de la base dans la région de la graine gARN, le 12.06 nt adjacent à l'APM; à l' inverse, mal assortit 5 'de la graine sont généralement tolérés ^16-17. L'ORD a introduit peut être réparé soit par l'extrémité non homologue de jonction (NHEJ) réparation de l'ADN ou d'homologie de réparation dirigée (HDR) mechanisms.NHEJ réparation de l'ADN crée souvent insertion / délétion (indels) de quelques pb au niveau du site cible qui peut perturber le cadre ouvert de lecture (ORF) d'un gène. Pour générer de plus grandes deletions dans le génome de deux ARNg, qui flanquent la région d'intérêt, peuvent être utilisés ^{18 à 19.} Cette approche est particulièrement utile pour l'étude des amplificateurs de transcription regroupés en régions de contrôle de locus ou super-amplificateurs qui sont plus grands que des amplificateurs conventionnels ^9,18,20-22.

Suppressions monoallélique sont un modèle précieux pour l' étude cis – régulation de la transcription. Le chang observée au niveau de la transcription après la suppression monoallélique d'un activateur est en corrélation avec le rôle de cet activateur dans la régulation des gènes sans les effets de confusion qui peuvent se produire lorsque la transcription des deux allèles est affecté potentiellement influencer remise en forme cellulaire. L'évaluation de l'expression réduite est difficile sans toutefois la capacité de distinguer la suppression de l'allèle de type sauvage. En outre, le génotypage délétions à chaque allèle sans la capacité de distinguer les deux allèles est difficile, surtout pour les grandes suppressions de> 10 kb à 1 Mb ²³ , dans lequel il est difficile d'amplifier toute la région de type sauvage par PCR. L'utilisation de cellules ES F1 générées par croisement avec ¹²⁹ Mus musculus Mus castaneus permet aux deux allèles d'être différenciés par PCR spécifique d'allèle ^18,24. Le génome hybride dans ces cellules facilite le dépistage de la suppression spécifique de l'allèle et l'analyse d'expression. En moyenne, il y a un SNP tous les 125 pb entre ces deux génomes, Offrant une flexibilité dans la conception de l'amorce d'expression et de génotypage analyse. La présence d'un SNP peut influer sur la température d' amorce de fusion _(Tm) et la spécificité de cible en temps réel par PCR quantitative (qPCR) d' amplification permettant une discrimination des deux allèles ^25. En outre , un mésappariement à l'intérieur de l' extrémité 3 'de l'amorce influence grandement la capacité de l' ADN polymérase pour s'étendre à partir de l'amorce empêchant l' amplification de l'allèle cible indésirable ^26. Décrite dans le protocole suivant est l'utilisation de cellules ES F1 pour allèle spécifique enhancer suppressions de plus de 1 kb et analyse de l' expression suivante en utilisant le / cas9 système de montage du génome CRISPR (figure 1).

Figure 1. suppression Enhancer utilisant CRISPR / cas9 pour étudier cis -regulation de l' expression génique. (A) Les cellules ES F1 générées par un croisement entre Mus musculus ¹²⁹ et Mus castaneus sont utilisés pour permettre la suppression allèle spécifique. (B) Deux ARN de guidage (ARNg) sont utilisés pour induire une grande deletion à médiation par cas9 de la région amplificatrice. (C) Les amorces sont utilisées pour identifier les grandes mono- et délétions bi-alléliques. Les amorces orange sont les amorces à l'intérieur, les amorces violet sont les amorces externes et les amorces vertes sont les amorces flanquant gARN. (D) Les changements dans l' expression des gènes sont surveillés à l' aide spécifique d'allèle qPCR. RFU désigne des unités de fluorescence relative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.