Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Elementos reguladores da transcrição são críticos para a sintonia fina espaço-temporais da expressão de genes durante o desenvolvimento e ^uma modificação destes elementos pode resultar em doença devido à expressão aberrante do gene ^2. Muitas regiões associados à doença identificadas por estudos de associação de genoma de largura estão em regiões não codificantes e têm características de potenciadores da transcrição ^3-4. Identificando potenciadores e combinando-os com os genes que regulam é complicado uma vez que são muitas vezes localizados vários quilobases de distância a partir dos genes que regulam e podem ser activados de um modo específico do tecido ^5-6. Previsões Enhancer são comumente baseado em marcas de modificação das histonas, complexos mediador-cohesin e ligação de transcrição específicos do tipo de célula fatores ^7-10. Validação dos intensificadores preditos é mais frequentemente feito por meio de um ensaio à base de vector em que o intensificador activa a expressão de um gene repórter ^11-12. Estes dados fornecem vinformações aluable sobre o potencial de regulamentação de sequências potenciadoras putativos mas não revelam a sua função no seu contexto genómico endógeno ou identificar os genes que eles regulam. edição genoma serve como uma ferramenta poderosa para o estudo da função dos elementos reguladores da transcrição no seu contexto endógeno por análise por perda de função.

Os avanços recentes na edição genoma, ou seja, a / Cas9 sistema de edição genoma CRISPR, facilitar a investigação da função genoma. O sistema / Cas9 CRISPR é fácil de usar e adaptável para muitos sistemas biológicos. A proteína Cas9 é direcionado para um site específico no genoma por um RNA guia (gRNA) ^13. O complexo SpCas9 / gRNA digitaliza o genoma para a sua sequência genómica alvo que deve ser 5 'para uma sequência adjacente protospacer motivo (PAM), NGG ^14-15. o emparelhamento de bases do gRNA ao seu alvo, a 20 nucleótidos (nt) sequência complementar ao gRNA, activa a actividade de nuclease SpCas9 resultando numa DOUBLpausa e Strand (DSB) 3 pb a montante da sequência PAM. Especificidade é conseguido através de emparelhamento de base completa na região da semente do gRNA, a 6-12 nt ao lado do PAM; Por outro lado, não corresponde 5 'da semente são geralmente tolerada ^16-17. O DSB introduzido podem ser reparados tanto por a extremidade não-homóloga de união (NHEJ) a reparação do ADN ou homologia reparação dirigida (HDR) mechanisms.NHEJ reparação do ADN, muitas vezes cria inserção / deleção (indels) de alguns pb no local alvo que pode perturbar a grelha de leitura aberta (ORF) de um gene. Para gerar delecções maiores no genoma dois gRNAs, que flanqueiam a região de interesse, podem ser usados ^​​18-19. Esta abordagem é particularmente útil para o estudo de potenciadores da transcrição aglomeradas em regiões de controlo local ou super-potenciadores, que são maiores do que melhoradores convencionais ^9,18,20-22.

Eliminações monoalélicos são um modelo valioso para estudar Regulamentação cis da transcrição. O chang observadoe no nível de transcrição após eliminação monoalélicos de um potenciador se correlaciona com o papel de que potenciador na regulação dos genes sem os efeitos de confusão que podem ocorrer quando a transcrição de ambos os alelos é afetado potencialmente influenciar a aptidão celular. Avaliando expressão reduzida é difícil no entanto, sem a capacidade de distinguir o excluído do alelo selvagem. Além disso, a genotipagem deleções em cada alelo sem a capacidade de distinguir os dois alelos é um desafio, em especial para grandes deleções de> 10 kb até 1 Mb ²³ em que é difícil para amplificar toda a região de tipo selvagem por PCR. A utilização de células ES F1 gerados pelo cruzamento de Mus musculus ¹²⁹ com Mus castaneus permite que os dois alelos de ser diferenciadas por PCR ^18,24 específico de alelo. O genoma híbrido nestas células facilita a eliminação específica alelo rastreio e análise de expressão. Em média, existe um SNP a cada 125 pb entre estes dois genomas, Proporcionando flexibilidade no desenho de primers para a expressão e genotipagem analisa. A presença de um SNP pode influenciar a temperatura de fusão do iniciador (T _m) e especificidade alvo em amplificação em tempo real quantitativa PCR (qPCR) permitindo a discriminação dos dois alelos ^25. Além disso, um desfasamento dentro da extremidade 3 'do iniciador influencia grandemente a capacidade de ADN-polimerase para estender a partir do iniciador de amplificação de prevenir o alvo alelo indesejada ^26. Descrito no seguinte protocolo é a utilização de células ES F1 para o alelo específico deleções potenciadoras de maior do que 1 kb e análise subsequente expressão que utilizam o sistema CRISPR / Cas9 edição genoma (Figura 1).

Figura 1. Enhancer eliminação utilizando CRISPR / Cas9 para estudar cis -reglação da expressão de genes (A) células F1 ES gerados por um cruzamento entre Mus musculus ¹²⁹ e Mus castaneus. são usadas para permitir a eliminação específica dos alelos. (B) Dois RNAs de guia (gRNA) são utilizados para induzir um grande deleção Cas9 mediada da região do potenciador. (C) Os conjuntos de iniciadores são utilizados para identificar grande mono- e bi-supressões alélicas. Os iniciadores de laranja são os primers dentro, os primers roxo são os iniciadores externos e os primers verdes são os iniciadores flanqueando gRNA. (D) As mudanças na expressão genética são monitorados através de qPCR alelo-específico. RFU denota unidades de fluorescência relativas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.