Summary

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

Published: February 23, 2016
doi:

Summary

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Abstract

Il limite principale di indagini NMR-based è bassa sensibilità. Questo richiede lunghi tempi di acquisizione, evitando misure NMR in tempo reale delle trasformazioni metaboliche. Iperpolarizzazione tramite dissoluzione DNP aggira parte della sensibilità emette grazie alla grande magnetizzazione nucleare fuori equilibrio derivante dal trasferimento polarizzazione di spin elettrone-to-nucleo. Il segnale alto NMR ottenuto può essere utilizzato per monitorare le reazioni chimiche in tempo reale. L'aspetto negativo di hyperpolarized NMR risiede nella finestra di tempo limitato disponibile per l'acquisizione del segnale, che è di solito dell'ordine di spin nucleare longitudinale costante di tempo di rilassamento, T 1, o, in casi favorevoli, dell'ordine della costante di tempo di rilassamento associato il singoletto-stato di nuclei accoppiati, T LLS. assorbimento cellulare di molecole endogene e tassi metabolici in grado di fornire informazioni essenziali per lo sviluppo del tumore e la risposta ai farmaci. Numerosi precedenti studi NMR hyperpolarized hanno dimostrato la pertinenza di piruvato come substrato metabolico per monitorare l'attività enzimatica in vivo. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della configurazione sperimentale e metodi richiesti per lo studio delle reazioni enzimatiche, in particolare il tasso piruvato-to-lattato conversione in presenza di lattato deidrogenasi (LDH), mediante NMR iperpolarizzato.

Introduction

Polarizzazione nucleare dinamica (DNP), 1,2 di una tecnica progettata per migliorare la polarizzazione di spin nucleare, vale a dire, lo squilibrio tra 'up' e 'down' popolazioni di spin (P = [N N] / [N + N ↓]), è stato introdotto nel 1950. Spin nucleari come 13 C possono essere polarizzati fino a P = 10 -1 in condizioni favorevoli, tipicamente ad una temperatura dell'ordine di 1 K e in un campo magnetico di 3.357 T. 3,4 Una svolta per applicazioni biologiche venuto nel primi del 2000 con lo sviluppo di scioglimento DNP che consiste nello sciogliere campioni polarizzati congelati in acqua surriscaldata pur mantenendo il livello di polarizzazione nucleare ottenuto a bassa temperatura. 5 il segnale NMR allo stato liquido è aumentata di un fattore 10 3 -10 4 rispetto ai Comunetermicamente polarizzato condizioni RT NMR. Dissoluzione DNP fornisce quindi un modo per misurare biochimico velocità di reazione non invasivo in situ in tempo reale, consentendo dinamiche monitoraggio di NMR con una risoluzione temporale di 1 sec o inferiore 6 -. 10 'diventato possibile rilevare analiti in concentrazioni molto basse 11.

Tra i non invasivi modalità di imaging molecolare, hyperpolarized NMR è l'unica tecnica che permette contemporaneamente misurare un substrato e dei suoi metaboliti in tempo reale. Dissoluzione DNP è stato ricevuto con entusiasmo in vari settori scientifici vanno da in vitro NMR per MRI clinica 12 e le applicazioni più promettenti sono legati al monitoraggio in situ del metabolismo. 13,14 Il principale limite di scioglimento DNP è che, dopo un tempo sulla dell'ordine di cinque volte il tempo di rilassamento longitudinale costante T 1, la migliorata polarezazione è perduto. È quindi necessario utilizzare molecole portanti spin nucleari espongono relativamente lungo T 1. Per estendere il lasso di tempo della valorizzazione di polarizzazione, lentamente-relax stati di spin nucleari, noti come stati longevi (LLS), può essere usato 15 -. 17 LLS sono insensibili al intra-coppia di interazione dipolo-dipolo, quindi la loro tempo di rilassamento caratteristica costante, T LLS, può essere molto più lungo di T 1. 18 Una vita di magnetizzazione di decine di minuti e fino a 1 ora potrebbe quindi essere ottenuto, 19,20 e LLS sono stati proposti sia per spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) e la risonanza magnetica. 21

I punti principali che devono essere attentamente ottimizzata per studiare tassi reazione enzimatica hyperpolarized NMR sono: (i) massimizzare la polarizzazione allo stato solido e (ii) ridurre al minimo la perdita di polarizzazione durante il trasferimento della soluzione iperpolarizzato dalpolarizzatore allo spettrometro NMR. Questo articolo descrive l'adattamento di un sistema di apparecchi e di iniezione DNP dissoluzione su misura per studiare le reazioni enzimatiche. Le caratteristiche e le prestazioni della messa a punto saranno dimostrate con il ben noto e diffuso substrato hyperpolarized [1- 13 C] piruvato. I motivi principali di questa scelta sono, in primo luogo, la sua naturale lungo 13 C tempo di rilassamento longitudinale (T 1> 50 sec a campi magnetici elevati e temperature superiori a 293 K) che permette le reazioni di monitoraggio durante alcuni minuti, e, dall'altro, il suo ruolo centrale nel cancro metabolismo. 13,14 Utilizzando dissoluzione DNP NMR e di un sistema di iniezione personalizzato sviluppato, l'ossidazione del piruvato catalizzata dalla lattato deidrogenasi (LDH) può essere monitorato in presenza di un pool iniziale di lattato non marcato 9,22 o senza lattato non marcato aggiunto , come mostrato qui. E 'stato dimostrato che il segnale lattato [1- 13 C] misurato in vivo (anche in cellule) dopo l'iniezione di iperpolarizzato [1- 13 C] piruvato è principalmente dovuta ad uno scambio un'etichetta veloce tra piruvato e lattato piuttosto che la produzione di lattato. 6

Presentiamo qui la produzione in tempo reale [1- 13 C] lattato dal piruvato iperpolarizzato [1- 13 C] iniettato in un tubo NMR contenente LDH ma inizialmente non lattato.

Descrizione del sistema
Ci sono due parti principali in una configurazione di dissoluzione DNP (Figura 1): il polarizzatore DNP e spettrometro NMR. L'elemento principale del polarizzatore DNP è un criostato al raffreddamento del campione a circa 1 K in un bagno di elio pompato. Il criostato è inserito in un superconduttore magnete 3,35 T e presenta una geometria che garantisce di avere il campione polarizzante all'isocentro del magnete (Figura 1). All'interno del criostato, il campione (a) è circondato da una bobina NMR (b), per misurare la polarizzazione buildup, contenuta in una cavità a microonde overmoded (c). L'intero campione viene mantenuto a bassa temperatura in un bagno di elio pompato (d) e irradiato con microonde attraverso la guida d'onda. L'intero sistema è gestito da un software su misura (Figura 2D).

L'hardware e le attrezzature criogeniche necessari per eseguire DNP ed il successivo scioglimento sono ancora una sfida tecnologica. Un nuovo DNP criostato 23,24 è stato sviluppato e testato per determinare le sue prestazioni criogenici e poi ottimizzata per un veloce raffreddamento, l'elio hold-tempo e il consumo globale di elio minimo durante il funzionamento.

Il criostato è costituito da due parti. La prima parte del criostato è dewar isolamento (Figura 2A) che possono essere grossolanamente diviso in parte superiore (a) la coda, o lo spazio campione (b), e la camera a vuoto esterna (OVC) tenuti sotto alto vuoto e l'alloggiamento della schermi di radiazione (c). La seconda parte del criostato è il principalesert (Figura 2B), inserito nel dewar isolante, in cui sono gestite tutte le normative di flusso. L'elio liquido proveniente dal dewar memorizzazione esterno attraverso la linea di trasferimento (a), è nella prima fase condensata nel separatore (b), una camera intermedia usato sia per tenere la parte superiore del freddo criostato e rimuovere l'elio evaporato durante il trasferimento. La pressione del separatore viene abbassato di pompaggio attraverso un capillare (c) avvolto intorno alla parte superiore del criostato; il flusso di elio freddo in questo capillare viene utilizzata per raffreddare i setti (d) e gli schermi di radiazione del dewar isolamento (OVC). Il campione è posto e polarizzata nello spazio campione. Lo spazio campione è collegato al separatore attraverso un altro capillare (e), avvolto intorno alla coda dell'inserto criostato principale. Questo capillare può essere aperto o chiuso tramite una valvola a spillo azionato manualmente dall'esterno.

Per ottenere la bassa temperatura usato per il pr DNPocess, l'elio liquido devono essere raccolti nello spazio campione criostato e la sua pressione abbassata alla gamma mbar. Le operazioni necessarie per il funzionamento criostato vengono eseguite tramite un sistema di pompaggio piuttosto complesso, con tre serie di pompe, monitorati e gestiti in diversi punti con strumenti elettronici e elettromeccanici (Figura 2C). Il criostato OVC deve essere pompata ad alto vuoto dal primo sistema di pompaggio. Questo sistema è composto da una pompa turbomolecolare sostenuto da una pompa rotativa (a). L'elio liquido viene trasferito dal dewar di stoccaggio (b) attraverso la linea di ingresso trasferimento criostato al separatore criostato. Il separatore ha una uscita collegata alla seconda serie di pompaggio. Questo insieme è composto da una pompa a membrana / hr 35 m 3 (c). Questa linea permette di rimuovere il gas elio bollito durante il trasferimento dal dewar e durante il raffreddamento separatore. L'elio liquido raccolto nel separatore può essere trasferita allo spazio campione attraverso il tappotubi Illary descritti sopra. Per trasferire elio liquido dal separatore allo spazio campione e successivamente abbassare la pressione spazio campione a mbar gamma, un terzo sistema di pompaggio composto da 250 m 3 / hr Roots pompa sostenuto da una / hr pompa rotativa 65 m 3 (d) è collegato al criostato attraverso una valvola a farfalla manuale (e).

Tutte le operazioni del sistema a vuoto sono controllati e regolati da un dispositivo elettropneumatico misura (f). Tale dispositivo controlla connessioni di linea di vuoto tra il separatore criostato (g) e lo spazio campione (h) punti, il secondo sistemi di pompaggio / terzi (c, d), una bottiglia di elio compresso (i) e l'esterno. La comunicazione tra (f) e l'esterno passa attraverso una valvola unidirezionale (j). Il dispositivo elettro-pneumatico (f) nonché tutti i parametri di sistema e l'hardware di dissoluzione sono controllati ed azionati da un dispositivo elettronico USB interfacciato misura con un comune PC. Infine tutto il sistema, attraverso l'elettronicadispositivo, è gestito da un software standalone su misura (Figura 2D) in cui le operazioni rilevanti vengono lanciate attraverso un'interfaccia utilizzando i tasti software.

Per gestire il campione e misurare NMR segnale accumulo allo stato solido sono utilizzati una serie di inserti (Figura 3A). Per preparare il criostato per la polarizzazione, posizionare l'inserto campione principale (a), nel criostato. L'inserto campione principale è provvisto di una bobina NMR (b) collocato all'interno di una cavità a microonde dorato overmoded. Pre-freeze substrato contenente soluzione da polarizzato (soluzione polarizzante) alla temperatura dell'azoto liquido in un contenitore idoneo campione e collocarlo nella parte inferiore fine del portacampioni vetroresina (c). Far scorrere il supporto del campione nella inserto campione principale per raggiungere la isocentro magnete. Inserire la guida d'onda placcato in oro (d) nel supporto del campione. La guida d'onda permette microonde generato da una sorgente di microonde esterna viaggiare con perdite minime to il campione.

Il software su misura per la gestione del criostato gestisce automaticamente, dopo aver fatto clic sul pulsante corrispondente interfaccia, diverse operazioni come cooldown (la temperatura criostato si abbassa vicino alla temperatura dell'elio liquido), riempiendo (criostato è riempito con elio liquido ad un livello predeterminato ), un ulteriore passaggio di raffreddamento a T ≈ 1 K (bagno di elio liquido viene pompato per raggiungere la temperatura più bassa possibile), pressurizzazione (criostato è pressurizzato pressione leggermente superiore camera al P = 10-30 mbar per consentire l'apertura criostato senza rischi di contaminazione del criostato aereo) e dissoluzione (procedura automatica per sciogliere il campione DNP e trasferire la soluzione risultante iperpolarizzato al sito di misura, cioè, lo spettrometro NMR).

La polarizzazione viene eseguito irradiando il campione con microonde a 94 GHz (in un campo di polarizzazione B 0 </sub> = 3.35 T). Un campione è considerato completamente polarizzato dopo 3 T DNP, dove T DNP è il tempo di polarizzazione accumulo. T DNP è dello stesso ordine di grandezza del tempo di rilassamento longitudinale dei nuclei bersaglio a stato solido al campo data e temperatura. In tutti gli esperimenti il campione è stato polarizzato per più di 5 T DNP.

Alla fine del tempo di polarizzazione, il campione deve essere sciolto in una soluzione RT per essere utilizzato per la misurazione dell'attività enzimatica. Durante il processo di dissoluzione, 5 ml di surriscaldato D 2 O dalla caldaia dell'inserto di dissoluzione (Figura 3B) sono spinte da gas elio compresso (P = 6-8 bar) per raggiungere il campione DNP-enhanced e farla sciogliere. La soluzione hyperpolarized risultante viene inserito l'inserto di dissoluzione del gas elio compresso attraverso l'uscita inserto di dissoluzione (Figura 3C-b </sTrong>), un diametro interno del tubo di trasferimento Teflon 2 mm. Il tempo necessario per il processo di dissoluzione è di 300 msec. 23 Il tempo necessario per il trasferimento del campione dal polarizzatore DNP al sito spettrometro NMR è di circa 3 sec.

Il processo di dissoluzione viene effettuata usando un inserto di dissoluzione (Figura 3B). L'inserto di dissoluzione è composto da un componente elettronico-pneumatico (a), un bastone in fibra di carbonio (b) contenente tubi di collegamento tra caldaia nel gruppo pneumatico e l'armadietto contenitore del campione (c), che consente l'accoppiamento a tenuta con il campione contenitore e indietro alla presa. Il gruppo elettro-pneumatico (Figura 3C) è utilizzato per produrre e guidare surriscaldato D 2 O attraverso il bastone fibra di carbonio per il contenitore del campione e poi estrarre la soluzione iperpolarizzato dal criostato. Il gruppo elettro-pneumatico è composto di valvole pneumatiche (a) che controllano i collegamenti tra il coelio mpressed (P = 6-8 bar) linea (b), la caldaia (c) se il D 2 O viene iniettato attraverso la valvola (d), e l'uscita (e) attraverso il bastone in fibra di carbonio (f). Il sistema è completato da un G pressione, un termometro e un filo resistivo riscaldamento in caldaia (c), un trigger (h) e una scatola di connessione (i) usato per interfacciare il sistema con il dispositivo di gestione elettronica.

Il criostato DNP e lo spettrometro NMR sono collegati da una linea di trasferimento, cioè, un tubo in PTFE di 2 mm di diametro interno all'interno del quale la soluzione iperpolarizzato viene spinto a elio in pressione (P = 6-8 bar) quando la dissoluzione viene attivata.

La sequenza di dissoluzione è composto dai seguenti operazioni: nei primi 300 msec, surriscaldato D 2 O viene spinto al contenitore del campione per sciogliere e dissolvere la soluzione congelata iperpolarizzato. Successivamente, la soluzione iperpolarizzato viene estratta dal criostato per mezzo di prespressurizzate (P = 6-8 bar) gas elio e spinto attraverso il tubo in PTFE di diametro interno di 2 mm (Figura 3C-e) al sito di misura in cui l'iniezione viene eseguita con una delle procedure descritte nella Fase 6.2.1 o Passo 6.2 .2.

Il secondo componente della dissoluzione configurazione DNP NMR è spettrometro NMR. Nella configurazione descritta, lo spettrometro NMR opera ad un campo B 0 = 11.7 Tesla. Una sonda NMR 5 millimetri è utilizzato per misurare il segnale iperpolarizzato dopo la dissoluzione. Lo spettrometro NMR è gestito tramite la console NMR, utilizzati sia per a stato solido e allo stato liquido misure NMR, ed il software XWinNMR ditta fornito. Una misura tipica è composta da un impulso rigido basso flip angle (sia tarato, per liquidstate o non calibrata, per misure a stato solido) seguita da acquisizioni del segnale.

Le misurazioni del segnale di polarizzazione termica allo stato solido e si DNP-derivatosegnal accumulo vengono eseguite usando la bobina misura 13 C al sito del polarizzatore DNP (Figura 3ab) accoppiato allo spettrometro NMR. In questa particolare situazione lo spettrometro NMR non effettua il bloccaggio del segnale. Quando le misurazioni a stato solido sono svolte, al fine di evitare perturbazioni significative alla polarizzazione, l'intervallo di tempo tra le acquisizioni dovrebbe essere abbastanza lungo, circa più di 0,5 T DNP.

L'enhancement a stato solido è definito come Equation4 dove Equation5 è il segnale iperpolarizzato (ottenuto nel passaggio 3.3) e Equation6 è il segnale a stato solido (ottenuto in equilibrio termico alla temperatura dell'elio liquido pompato nel passo 3.2) (Figura 4A). Questo parametro Defines la polarizzazione massima disponibile per esperimenti NMR, prima inevitabili perdite durante il trasferimento della soluzione iperpolarizzato. La misura viene eseguita con una semplice sequenza di impulsi-acquisiscono utilizzando un basso medaglia impulso angolo non calibrato. calibrazione Pulse è comunemente saltato per le misurazioni stato solido.

Una procedura analoga può essere utilizzata per determinare il potenziamento del segnale iperpolarizzato nello stato liquido. In questo caso, il campione posto nel tubo spettrometrico prima dell'iniezione (passo 6.2) è composto da 500 ml di D 2 O. Dopo la dissoluzione e iniezione, ci sono due parametri importanti da monitorare. Il primo è il miglioramento iperpolarizzato nel sito spettrometro NMR, Equation7 (Figura 4B), dove Equation8 è il segnale subito dopo l'iniezione del iper soluzione polarizzata (ottenuta nel passo 7.1) e Equation9 è il segnale di polarizzazione termica (ottenuto nel passo 7.2). Il secondo è il tempo di rilassamento longitudinale, T 1 (Figura 4B, riquadro), associato con il substrato ed ogni prodotto metabolico (ottenuto da segnali esponenziali montaggio ottenuti nel passo 7.1). Questi due parametri definiscono la concentrazione minima del substrato necessaria per ottenere un rapporto sufficiente segnale-rumore (SNR) e la finestra di tempo disponibile per la misura delle trasformazioni metaboliche. Il rapporto tra la polarizzazione a stato solido Equation10 e polarizzazione liquidstate Equation11 dà una stima delle perdite dovute alla polarizzazione relax durante il trasferimento soluzione iperpolarizzato. Un valoreation12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> dovrebbe essere osservata in assenza di perdite di rilassamento.

Protocol

NOTA: Tutte le analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software commerciale. 1. Preparare la soluzione polarizzante Preparare 2 ml di piruvato di sodio 1,12 M 13 C-marcato (Na + [CH 3 COO -CO- 13] -, substrato) soluzione drogato con 33 mM di TEMPOL radicale (4-idrossi-2,2,6,6 tetrametilpiperidin-1-oxyl, agente polarizzante) 4 a 2: 1 d 2 O / d 6 -etanolo per 13 C osservazioni. ATTENZIONE: Prec…

Representative Results

guadagni segnale NMR utilizzando dissoluzione DNP L'effetto DNP consiste nel trasferimento della elevata polarizzazione degli spin elettrone spaiato, tipicamente da molecole di radicali stabili, a nuclei NMR attivi, sotto irradiazione con microonde del campione. I radicali liberi più spesso utilizzati sono TAM (OXO63) e TEMPOL. 4 procedure di polarizzazione utilizzando TEMPOL possono essere ottimizzate da 'polarizzazione incrociata'. 25 <p cl…

Discussion

I punti critici della dissoluzione dell'esperimento DNP NMR sono: (i) il livello della polarizzazione raggiunto per il substrato, che determina la concentrazione di prodotto minima necessaria per esperimenti nonché il numero di acquisizioni di segnali che possono essere eseguite e (ii) le durate della magnetizzazione, rispetto alla durata del trasferimento polarizzazione e siti di rilevamento e al tasso di substrato trasformazione. Il sistema di iniezione del setup DNP dissoluzione qui descritto consente il trasfer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Dr JJ van der Klink per l'assistenza nella scelta e montaggio delle attrezzature, così come Dr F. Kateb e il dottor G. Bertho per le discussioni utili. AC è stato sostenuto dal National Science Foundation svizzero (Grant PPOOP2_157547). Noi riconosciamo il finanziamento da Parigi Sorbonne Cité (NMR @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, la Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708), e il Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Il nostro team è parte dei programmi di Equipex Paris-en-RISONANZA e CACSICE.

Materials

DNP polarizer Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) /// Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components Edwards vacuum (France) Various

– turbomolecular pumping setup

– membrane pumping setup

– high capacity roots pumping system

– vacuum fittings and components

DNP 3.35T Magnet Bruker (France)
500MHz NMR Spectrometer Bruker (France)
Origin 8.0 OriginLab (US) Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C Sigma Aldrich (France) 490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D Sigma Aldrich (France) 186414
 4-Hydroxy-TEMPO 97% Sigma Aldrich (France) 176141
Deuterium oxide Sigma Aldrich (France) 151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0 Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in  Sigma Aldrich (France) L-2500
bovine serum albumin, BSA Sigma Aldrich (France)

References

  1. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  2. Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395 (1978).
  3. Wolber, J., Ellner, F., et al. Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization. Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).
  4. Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals. PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).
  5. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  6. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
  7. Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging. JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).
  8. Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction. An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).
  9. Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR. NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).
  10. Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy. Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).
  11. Lerche, M. H., Meier, S., et al. Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism. NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).
  12. Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108 (2013).
  13. Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
  14. Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function. Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).
  15. Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields. PRL. 92 (15), 153003 (2004).
  16. Carravetta, M., Levitt, M. H. Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field. J. Chem. Phys. 122 (21), 214505 (2005).
  17. Vasos, P. R., Comment, A., et al. Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization. PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).
  18. Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance. JMR. 239, 81-86 (2014).
  19. Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution. JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).
  20. Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution. Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).
  21. Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer. MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).
  22. Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).
  23. Comment, A., van den Brandt, B., et al. Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner. Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).
  24. Balzan, R. . Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, 1-140 (2013).
  25. Bornet, A., Melzi, R., et al. Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization. JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).
  26. Bowen, S., Hilty, C. Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy. PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).
  27. Cavadini, S., Vasos, P. R. Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy. Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).
  28. Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Long-lived States in Multiple-Spin Systems. Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).
  29. Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states. Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).
  30. Sarkar, R., Comment, A., et al. Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization. JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).

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Balzan, R., Fernandes, L., Comment, A., Pidial, L., Tavitian, B., Vasos, P. R. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J. Vis. Exp. (108), e53548, doi:10.3791/53548 (2016).

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