We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Les phospholipides sont des composants majeurs des membranes cellulaires et les membranes des organelles, et la fluidité de ces couches membranaires affecte souvent les fonctions cellulaires en modifiant l'activité de protéines de la membrane 1 – 3. Par exemple, la membrane homéostasie lipidique est obtenue par le contrôle de la fluidité de la membrane, qui est détecté par les protéines de membrane, et un niveau anormal de fluidité provoque des maladies graves, telles que la stéatose hépatique et cholestase 4. En outre, la fluidité d'une monocouche de phospholipides à l'interface fluide-air alvéoles a des implications importantes dans ses fonctions. Haute fluidité du surfactant pulmonaire phospholipides monocouche facilite la propagation de la couche pendant l'inhalation, tandis qu'une fluidité à basse permet à la couche de rester dans les alvéoles lors de l'expiration de 5,6. Il est donc important d'évaluer la fluidité des couches de phospholipides de comprendre leurs rôles.
_content "> Une mesure directe de la fluidité est la viscosité et la viscosité des couches de phospholipides a été mesurée en utilisant des colloïdes de taille micronique 7, aiguilles magnétiques 8,9, et les micro-boutons magnétiques 6,10,11. Cependant, ces techniques sont limités à des films relativement rigides, et ne peut pas mesurer les films moins visqueux. Pour de tels cas, diffusivité serait une alternative à quantifier la fluidité des couches de phospholipides. Depuis plusieurs décennies, une variété de techniques pour mesurer les propriétés de diffusion des couches de phospholipides ont été développés, tels que la fluorescence procédé de trempe 12, champ pulsé gradient RMN 13, et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) 14. Une des méthodes les plus représentatifs est la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) 15,16. En raison de la simplicité de la procédure de mesure et connexes théories, plusieurs études sur les propriétés de diffusion des couches de phospholipides ont été effectuées en utilisant FRAP <sup> 17 – 19. Cependant, FRAP nécessite généralement une configuration microscope confocal cher avec un laser de forte puissance.Ici, nous présentons une nouvelle technique pour mesurer la diffusion latérale de monocouches de phospholipides, appelé comme la récupération de fluorescence après la fusion (FRAM). La principale différence entre le FRAP et FRAM est que l'étape de photoblanchiment est remplacé par la coalescence des gouttes. Fusion d'une gouttelette couverte par des non-fluorescence monocouche sur une monocouche plat marqué par fluorescence laisse une tache sombre circulaire sur une monocouche appartement lumineux, mettant ainsi en place le même état initial avec l'étape de photoblanchiment. On assiste alors à la récupération de fluorescence dans la tache sombre avec le temps pour mesurer la diffusivité latérale. Cette nouvelle "blanchiment" étape de coalescence de gouttes fournit des avantages significatifs par rapport FRAP: FRAM ne nécessite qu'un microscope à fluorescence plutôt que d'un microscope confocal cher avec un laser de forte puissance qui est nécessaire pour FRAP. jen outre, FRAM dispose d'une large sélection de colorants fluorescents car elle ne comporte pas le processus de photoblanchiment. Enfin, les deux monocouches différentes, une monocouche de gouttelettes et une monocouche plat, peuvent être préparés de façon indépendante, ce qui permet interdiffusion à mesurer, tandis que FRAP ne mesure que l'auto-diffusion de monocouches.
FRAM offre une large gamme de mesures de diffusion à partir de matériaux très visqueux à des matériaux presque non-visqueux. A priori, FRAM peut mesurer la diffusivité maximum de 10 6 um 2 / sec, ce qui est comparable aux techniques existantes, lorsque la diffusion a lieu à travers la zone 100 um par 100 um pendant le temps pour le processus de coalescence de gouttes (~ 10 msec). En outre, lent processus de diffusion peut être facilement mesurée à moins monocouches sont solides. FRAM peut être utilisé pour toutes sortes de matières actives de surface aussi longtemps que les molécules étiquetées par fluorescence appropriés sont disponibles.
FRAM partage un grand nombre de principes fondamentaux avec FRAP, en particulier pour la mesure de la récupération de fluorescence après blanchiment d'une zone spécifique, mais FRAM utilise un processus de fusion goutte sur l'interface plane pour former une zone blanchie, au lieu d'appliquer une lumière intense. Le processus de fusion est donc l'étape la plus importante dans FRAM, et surtout, la forme de la tache sombre à la monocouche plat après la fusion d'une gouttelette détermine la précision de la mesure de diffusivité. Plus précisément, sur la base d'une méthode actuelle, nous ne fixons le cercle avec un rayon R comme une région d'intérêt pour calculer l'intensité moyenne de la tache sombre, montré dans la procédure 4, et si il ya un trop écart par rapport à la forme circulaire, ce serait perturber la mesure précise d'un coefficient de diffusion. Par conséquent, il est nécessaire d'obtenir une région sombre de forme circulaire, mais, des formes non circulaires sont formés de temps en temps pour plusieurs raisons. Tout d'abord, si il existe un flux de convection dans le Petplat ri, la forme de la zone sombre devient allongée le long de la direction de l'écoulement. Comme mentionné dans la procédure 1.3, un appareil en forme de cône aide à supprimer le flux de convection, et cet allongement serait minimisé. Deuxièmement, si l'extrémité de la pointe capillaire de l'interface en contact à plat au cours d'un processus de fusion, la zone sombre est formé avec une variété de formes depuis l'extrémité de capillaire interrompt le processus de fusion. En obtenant une gouttelette qui est seulement suspendu à partir de la fin du capillaire, cette interruption peut être empêchée. En particulier, un traitement hydrophobe du capillaire permet la gouttelette de siéger à la toute fin du capillaire. Par conséquent, des fusillades et des modifications de la panne ci-dessus nous permettent de mesurer les propriétés de diffusion plus précisément.
Ce processus bien dépanné permet ainsi FRAM d'avoir plusieurs avantages significatifs par rapport FRAP. Tout d'abord, FRAM nécessite un équipement simple par rapport à FRAP. Pour FRAM, il suffit d'utiliser un simple micros de fluorescencefaire face, au lieu d'un microscope confocal cher avec un laser de forte puissance dont la longueur d'onde doit correspondre avec le spectre d'absorption du colorant. En outre, il est nécessaire d'utiliser un appareil supplémentaire pour ajuster la taille de la zone blanchie dans la FRAP, tandis que le FRAM contrôle la taille de la zone facilement par ajustement de la taille de la goutte, ou la pression de surface à la surface des gouttelettes. Deuxièmement, il est possible d'utiliser diverses espèces de colorants dans FRAM. FRAP utilise uniquement des molécules de colorant dont le processus de blanchiment est beaucoup plus rapide que le processus de diffusion. Si la diffusion des colorants se produit pendant le processus de blanchiment, il est difficile d'estimer la propriété de diffusion de façon précise. Le FRAM, cependant, ne nécessite pas un procédé de décoloration des colorants, ce qui permet ainsi l'utilisation de divers types de colorants dans l'imagerie de fluorescence. En outre, le FRAP nécessite lasers de forte puissance supplémentaires et le filtre se met à changer les espèces tinctoriales, alors qu'il est seulement nécessaire de remplacer les jeux de filtres dans la FRAM. finalementÉtant donné que les monocouches à la surface des gouttelettes et l'interface plat peut être formé de façon indépendante, ce qui permet l'étude de l'inter-diffusion ou de mélange entre deux monocouches lipidiques différents par fusion de monocouche de type B monocouche de type A, tandis que le FRAP ne mesure la autodiffusion d'une monocouche.
Malgré ces avantages, le processus de fusion goutte sur une interface air-eau plat peut potentiellement limiter cette technique en raison de plusieurs questions qui pourraient être source de préoccupation, comme une incompatibilité de pression de surface entre les deux monocouches, l'échelle de temps du processus de fusion et une augmentation de la pression de la monocouche de surface plate après la fusion des gouttelettes. Ces questions, cependant, ne portent pas atteinte à la mesure de la diffusion de manière significative pour les raisons suivantes. Tout d'abord, même si les pressions de surface à deux monocouches différents sont tout à fait différent, un processus d'équilibrage achevé à un stade très précoce au cours du processus de récupération. Par exemple, si til pression de surface de la monocouche sur la surface de la gouttelette est plus élevée que celle de la monocouche à l'interface air-eau à plat, la zone sombre se développe jusqu'à ce que la pression superficielle se équilibre. Etant donné que ce processus soit achevé dans les 10 ms, la pression de surface sera équilibrée avant qu'il affecte le processus de diffusion de manière significative. Deuxièmement, si l'échelle de temps du processus de fusion est suffisamment rapide, elle ne limite pas la mesure de la diffusion du tout. Heureusement, un processus de fusion typique est également terminé dans les 10 msec. Enfin, même multiple fusion des gouttelettes sur l'interface plane ne pas augmenter la pression de surface depuis la surface de la cuvette est beaucoup plus grande que l'aire de surface de la gouttelette. Selon les dimensions de l'auge et les gouttelettes, décrit dans le protocole, l'aire par molécule augmente de moins de 0,015% en fusion d'une gouttelette. En conséquence, l'augmentation de la pression de surface en raison de la modification de surface par molécule est inférieur à 0,1%, ce qui est negligible car elle est beaucoup plus petite que l'erreur type de la pression de surface, telle que mesurée par plaque de Wilhelmy tensiomètre.
En résumé, nous avons introduit une nouvelle méthode pour mesurer la propriété latérale de diffusion d'une monocouche de phospholipides en fusionnant une monocouche de gouttelettes sur l'interface plat. Cette technique nécessite un équipement relativement simple et permet également l'utilisation de diverses sortes d'espèces de colorants. Le FRAM est donc potentiellement applicable à la mesure de la diffusion de tous les agents tensio-actifs, y compris des phospholipides, des copolymères séquences, des protéines et même des nanoparticules à une interface liquide-liquide. En outre, nous nous attendons à ce que le FRAM offre une nouvelle façon d'étudier l'inter-diffusion ou de mélange entre deux agents actifs de surface différents.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par le projet financé par le KAIST K-Vallée Rouge & B pour 2014 et le programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |