We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Fosfolipiden zijn belangrijke componenten van celmembranen en de membranen van organellen, en de vloeibaarheid van deze membraanlagen tast vaak celfuncties door het veranderen van de activiteit van membraaneiwitten 1 – 3. Bijvoorbeeld membraan lipide homeostase wordt bereikt door het regelen membraanfluïditeit, die wordt gedetecteerd door membraaneiwitten en een abnormaal niveau van vloeibaarheid veroorzaakt ernstige aandoeningen, zoals hepatische steatose en cholestase 4. Daarnaast vloeibaarheid van een fosfolipide monolaag aan het lucht-longblaasjes vloeistof interface heeft belangrijke implicaties in zijn functies. Hoge vloeibaarheid van de long oppervlakteactieve fosfolipide monolaag vergemakkelijkt de verspreiding van de laag tijdens inademing, terwijl een lage vloeibaarheid maakt de laag binnen de longblaasjes te blijven tijdens het uitademen 5,6. Het is dus belangrijk om een schatting van de vloeibaarheid van de fosfolipide lagen hun rol begrijpen.
_content "> een directe maat voor de vloeibaarheid viscositeit en de viscositeit van fosfolipide lagen werd gemeten met behulp van microscopisch kleine colloïden 7, magneetnaalden 8,9 en magnetische micro-toetsen 6,10,11. Echter deze technieken zijn beperkt tot betrekkelijk harde folie en kan minder viskeus films meten. Voor dergelijke gevallen zou diffusie alternatief vloeibaarheid fosfolipide lagen kwantificeren. Sinds enkele jaren is een verscheidenheid van technieken om de diffusie-eigenschappen van fosfolipiden lagen meten ontwikkeld zoals fluorescentiedoving methode 12, gepulseerde veldgradiënt NMR 13 en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) 14. Een van de meest representatieve methoden fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) 15,16. Door de eenvoud van de meting en verwante theorieën, verschillende studies op diffusie eigenschappen fosfolipide lagen werden uitgevoerd met behulp FRAP <sup> 17 – 19. Echter, FRAP vereist gewoonlijk een dure confocale microscoop opstelling met een high-power laser.Hier presenteren we een nieuwe techniek om de laterale diffusie fosfolipide monolagen, genoemd als fluorescentieherstel meten na het samenvoegen (FRAM). Het belangrijkste verschil tussen FRAP en FRAM is dat de fotobleken stap wordt vervangen door de daling van de samenvoeging. Samenvoegen van een druppel gedekt door niet-fluorescentie monolaag op een fluorescent label plat monolaag laat een circulaire donkere vlek op een heldere vlakke monolaag, waardoor het opzetten van de dezelfde oorspronkelijke staat met de fotobleken stap. We zien dan de fluorescentie herstel in de donkere vlek met de tijd om de laterale diffusie te meten. Deze nieuwe "bleken" stap druppel coalescentie biedt aanzienlijke voordelen boven FRAP: FRAM vereist slechts een fluorescentiemicroscoop plaats van een dure confocale microscoop met een hoog vermogen laser die noodzakelijk is voor FRAP. Ikn Bovendien FRAM heeft een brede selectie van fluorescentie kleurstoffen, omdat het niet gaat om het fotobleken proces. Tenslotte, de twee monolagen, een druppel monolaag en een vlakke monolaag, worden afzonderlijk bereid, waardoor interdiffusie te meten, terwijl FRAP meet alleen de zelfdiffusie van monolagen.
FRAM biedt een breed scala van diffusie metingen van zeer viskeuze materialen aan bijna wrijvingsloze materialen. In principe kan FRAM de maximale diffusie van 10 6 pm 2 / sec, wat vergelijkbaar is met bestaande technieken te meten, wanneer het diffusie optreedt door het gebied 100 um van 100 urn in de tijd voor de drop coalescentie proces (~ 10 msec). Bovendien kan langzame diffusieproces eenvoudig worden gemeten, tenzij monolagen zijn solide. FRAM kan worden gebruikt voor alle soorten van oppervlakteactieve stoffen zolang geval fluorescent gemerkte moleculen zijn.
FRAM deelt veel grondbeginselen met FRAP, in het bijzonder voor het meten van fluorescentie herstel na het bleken van een bepaald gebied, maar FRAM maakt gebruik van een proces van het samenvoegen van een druppel op de platte interface naar een gebleekte gebied te vormen, in plaats van het toepassen van een intensief licht. Het samenvoegproces is dus belangrijkste stap in FRAM, en met name de vorm van de donkere vlek in het vlakke monolaag na het samenvoegen een druppel bepaalt de nauwkeurigheid van de meting diffusie. Specifiek, op basis van een huidige methode, stellen we alleen de cirkel met een straal R als een van belang om de gemiddelde intensiteit van de donkere vlek, getoond in procedure 4 berekenen en als er teveel afwijking van de cirkelvorm, Dit zou de precieze meting van een diffusiecoëfficiënt verstoren. Daarom is het noodzakelijk om een cirkelvormige donkere gebied te verkrijgen, maar niet-cirkelvormige vormen worden soms gevormd als gevolg van verschillende redenen. Ten eerste, als er een convectieve stroming in de Petri schotel, de vorm van het donkere gebied wordt uitgerekt langs de stroomrichting. Zoals vermeld in proces 1,3, een kegelvormige inrichting helpt de convectieve stroming te onderdrukken en deze rek zal worden geminimaliseerd. Ten tweede, indien het uiteinde van de capillaire raakt het vlakke weergegeven tijdens een fusieproces, wordt het donkere gebied gevormd met een verscheidenheid aan vormen sinds capillairuiteinde onderbreekt het samenvoegproces. Door het verkrijgen van een druppel die alleen opknoping vanaf het uiteinde van de capillair, kan deze onderbreking voorkomen. Vooral een hydrofobe behandeling van het capillair helpt de druppel te zitten aan het einde van het capillair. Daarom boven moeite schietpartijen en wijzigingen stellen ons in staat om de verspreiding eigenschappen nauwkeuriger te meten.
Deze goed troubleshot proces maakt het dus mogelijk FRAM om een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van FRAP. Ten eerste FRAM vereist eenvoudigere apparatuur opzichte FRAP. Voor FRAM, volstaat een eenvoudige fluorescentie micros gebruikengaan, in plaats van een dure confocale microscoop met een hoog vermogen laser waarvan de golflengte moet overeenkomen met het absorptiespectrum van de kleurstof. Bovendien is het noodzakelijk om aanvullende inrichting te gebruiken om de grootte van het gebleekte gebied in de FRAP regelen terwijl het FRAM bepaalt de grootte van het gebied gemakkelijk door de omvang van de druppel, of oppervlaktedruk op druppeloppervlak. Ten tweede is het mogelijk verschillende soorten kleurstoffen gebruiken FRAM. FRAP gebruikt alleen kleurstofmoleculen waarvan bleekproces is veel sneller dan het diffusieproces. Indien tijdens het bleekproces de diffusie van de kleurstoffen plaatsvindt, is het moeilijk om de woning diffusie nauwkeurig te schatten. Het FRAM echter niet nodig een werkwijze voor het bleken van kleurstoffen en dit maakt het aldus mogelijk het gebruik van verschillende soorten kleurstoffen in de fluorescentiebeeldvorming. Bovendien, de FRAP vereist extra hoogvermogen lasers en filtersets om de kleurstof species te veranderen, terwijl het slechts noodzakelijk de filtersets vervangen in het FRAM. EindelijkAangezien de monolagen van het druppeloppervlak en de vlakke-interface kan onafhankelijk worden gevormd, waardoor de studie van inter-diffusie mogelijk of menging van twee lipide monolagen door het samenvoegen A-monolaag B-type monolaag, terwijl de FRAP meet alleen de zelfdiffusie van een monolaag.
Ondanks deze voordelen, kan het proces van het samenvoegen van een druppel op een vlakke lucht-water-interface mogelijk deze techniek te beperken als gevolg van een aantal problemen die van belang zou kunnen zijn, zoals een oppervlakte druk mismatch tussen de twee monolagen, de tijdschaal van de fuserende proces en een verhoging van de oppervlaktedruk van de vlakke monolaag na het samenvoegen druppels. Deze kwesties, maar hebben geen invloed op de verspreiding meten aanzienlijk om de volgende redenen. Ten eerste, alhoewel de oppervlaktedrukken op twee monolagen zijn nogal verschillend wordt een equilibratie voltooid in een vroeg stadium tijdens het herstelproces. Bijvoorbeeld, als tHij oppervlaktedruk van de monolaag op het druppeloppervlak hoger dan die van de monolaag op het vlakke lucht-water grensvlak, het donkere gebied expandeert totdat de vlaktedruk in evenwicht. Aangezien dit proces is voltooid binnen 10 ms, zal de oppervlakte druk worden in evenwicht gebracht voordat deze van invloed op de diffusie proces aanzienlijk. Ten tweede, als de tijdschaal van de fuserende proces is snel genoeg, is het niet de diffusie meting helemaal beperken. Gelukkig is een typische samensmelting proces ook voltooid binnen 10 msec. Tenslotte, zelfs meerdere samenvoeging van de druppels op de vlakke-interface kan de oppervlaktedruk, omdat het oppervlaktegebied van de goot niet te verhogen is veel groter dan het oppervlak van de druppel. Volgens de afmetingen van de goot en de druppels in het protocol beschreven, de oppervlakte per molecuul toeneemt minder dan 0,015% door het samenvoegen van een druppel. Dienovereenkomstig, de toename van vlaktedruk door de verandering van de oppervlakte per molecuul kleiner is dan 0,1%, wat negligible omdat het veel kleiner is dan de typische fout in oppervlaktedruk, gemeten Wilhelmy plaat tensiometer.
Samengevat hebben we een nieuwe methode om de laterale diffusie eigenschap van een fosfolipide monolaag meten door het samenvoegen van een druppel monolaag op de platte-interface geïntroduceerd. Deze techniek vereist relatief eenvoudige apparatuur en maakt ook het gebruik van verschillende soorten kleurstof species. Het FRAM is dus potentieel toepasbaar voor diffusiemeting van elke oppervlakteactieve stoffen, waaronder fosfolipiden, blokcopolymeren, eiwitten en zelfs nanodeeltjes in een vloeistof-vloeistof interface. Verder verwachten we dat de FRAM biedt een nieuwe manier om de inter-verspreiding of vermenging tussen twee verschillende oppervlakte-actieve stoffen te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door de KAIST gefinancierde K-Valley RED & B Project voor 2014 en de Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |