Identification des nanoparticules d'oxyde de métal dans des échantillons histologiques par cartographie Darkfield Microscopie et hyperspectrale Enhanced
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
Comme nanomatériaux sont de plus en plus utilisés dans une variété d'industries et d'applications, il est nécessaire pour l'imagerie à l'échelle nanométrique et de caractérisation des méthodes qui sont plus rapide, abordable et pratique que les modalités traditionnelles, telles que la microscopie électronique. Pour visualiser nanoparticules (NP) interactions avec les cellules, les tissus et les systèmes vivants, de nombreuses techniques optiques ont été employées, y compris contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie 1 et les approches de terrain évanescentes, tels que la réflexion totale interne (TIR) ou quasi- microscopie à balayage de champ optique (SNOM) 2,3. Cependant, ce sont les approches analytiques haut de gamme, hors de portée de la plupart des laboratoires non spécialisés 4. La microscopie électronique, notamment la microscopie électronique à transmission (TEM), a également été utilisée pour étudier l'interaction des cellules avec NP 5,6,7,8. Haut-angle fond noir annulaire (HAADF) microscopie électronique à transmission à balayage a été utilisée pour étudier l'interaction des IP9 par des virus. La microscopie confocale est une autre technique populaire utilisé pour étudier les interactions cellulaires NP-10.
Au cours des dernières années, l'imagerie hyperspectrale (HSI) techniques basées sur fond noir-ont été utilisés comme un outil analytique prometteuse pour l'étude des PN dans les matrices biologiques 11. HSI systèmes génèrent une représentation tridimensionnelle de données spatiales et spectrales, connu comme un hypercube ou Datacube 12. La carte spatiale de variation spectrale est utilisé pour l'identification des matières. Les profils spectraux des matériaux connus peuvent être générés et utilisés en tant que bibliothèques de référence pour la comparaison avec des échantillons inconnus. L'un des principaux avantages des systèmes d'IHV est sa capacité à combiner l'imagerie par spectroscopie, établissant ainsi l'emplacement et de la distribution des IP inconnus in vivo ou ex vivo ainsi que les relier à une autre particule de connu, composition similaire référence.
Il existe plusieurs avantagesen utilisant des systèmes d'IHV sur les techniques d'imagerie classiques: préparation de l'échantillon minimal est nécessaire; préparation de l'échantillon est typiquement non-destructive dans la nature; acquisition et d'analyse d'image est plus rapide; la technique est rentable 13; et la distribution spatiale et l'analyse des composés de composition mixte et / ou dans des matrices complexes est plus facilement accompli 14.
Pour la recherche sur les nanomatériaux impliquant précieux échantillons, l'un des aspects les plus importants est la disponibilité d'une méthode d'imagerie non destructive, ce qui permet d'examiner le potentiel de façon répétée des échantillons par une ou plusieurs méthodes. Répétées ou multiples analyses peut être souhaitable de développer des jeux de données complets qui ne seraient pas disponibles à partir d'une seule méthode. Pour cet égard, l'étude de ses propriétés optiques est le plus sûr moyen d'analyser l'échantillon. En utilisant un microscope à fond noir amélioré (EDFM) et le système HSI pour étudier la réponse optique de l'échantillon – à savoir Reflectance, mais aussi absorbance et de transmission – l'identification et la caractérisation de fonction peut être effectuée 15. Paramètres de caractérisation potentiels comprennent une évaluation de la taille relative et la forme de nanoparticules ou des agglomérats et la distribution des nanoparticules dans un échantillon.
Dans cet article, nous décrivons les méthodes de cartographie spécifiquement pour les nanoparticules d'oxyde de métal dans les tissus post-mortem en utilisant un système HSI basé sur un algorithme de correspondance pixel-spectrale appelé mappeur angle spectrale (SAM). Nous avons choisi cette application particulière, car elle a le potentiel de compléter actuel et futur de la recherche en nanotoxicologie vivo, dans laquelle des modèles animaux sont utilisés pour évaluer les conséquences sanitaires de l'exposition aux nanomatériaux manufacturés. L'application de cette méthode pourrait également informer recherche à l'échelle nanométrique de délivrance de médicament qui utilise des modèles de tissus ou animales. En particulier, l'absorption de nanoparticules, la distribution, le métabolisme et l'excrétion long organs et les tissus pourraient être étudiés avec ce système. Une grande variété d'applications sont à l'étude pour une utilisation dans la recherche biomédicale 11.
Cette méthode pourrait être utilisée pour l'évaluation de différents échantillons biologiques (tels que les types différents tissus, d'échantillons de lavage broncho-alvéolaire et les frottis de sang) qui ont été exposés à des nanoparticules d'une variété de compositions élémentaires 16-19. En outre, ce procédé est utile pour l'étude de la biodistribution des nanoparticules in vivo et in vitro, ce qui est pertinent pour des études d'administration de médicament 11 à l'échelle nanométrique. Au-delà des échantillons biologiques, EDFM et HSI peuvent être utilisés pour évaluer les nanoparticules dans les échantillons environnementaux, comme les eaux usées 20. Évaluation de l'exposition professionnelle peut être facilitée par l'utilisation de cette technique aussi bien, car il peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de l'équipement de protection personnelle pour prévenir la pénétration de nanoparticules. En outre, la te de rechercheh développe actuellement un EDFM similaire et HSI protocole pour l'évaluation d'échantillons de supports filtrants de nanoparticules recueillies lors des évaluations d'exposition professionnelle. Bien que ces types de préparation de l'échantillon pour différents EDFM HSI et peut varier, il est important qu'elles sont préparées d'une manière telle qu'ils peuvent être facilement visualisés par le système optique. Typiquement, l'échantillon doit être préparé comme si elle allait être visualisée par microscopie en fond clair traditionnel. Il existe plusieurs systèmes d'imagerie hyperspectrale disponibles dans le commerce 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour les échantillons de tissus qui ont subi coloration histologique classique, l'identification et l'analyse des nanoparticules d'oxyde de métal peuvent être atteints grâce à une combinaison de EDFM, cartographie HSI, et des techniques d'analyse d'images. Bien qu'il y ait une flexibilité dans la préparation d'échantillons pour l'histologie ou immuno-histochimie (par exemple, en utilisant des tissus fixes ou congelés; type de tache), il est important que les échantillons sont coupés à une épaisseur de 5 à 10 um pour une visualisation optimale. Les échantillons utilisés étaient ici fixés au formol et inclus en paraffine avant la coupe avec un microtome rotatif à 6 um d'épaisseur, monté sur des lames de microscope en verre, colorées à l'hématoxyline et à l'éosine et lamelle. Tissus de la peau porcine en provenance de l'ex vivo cutanée collaboration pénétration de toxicologie ont été utilisés pour cette étude. Les tissus ont été exposés à des nanoparticules d'oxyde de métal (alumine, silice, oxyde de cérium) dans des suspensions aqueuses. Détection de la région (s) d'intérêt (contraste élevé elements) avec EDFM est une première étape essentielle qui facilite ultérieure cartographie et l'analyse HSI. Échantillons de contrôle positifs et négatifs doivent être visualisés et analysés en premier afin de créer une bibliothèque spectrale pour référence. Les spectres collectés à partir du contrôle positif sont exportés vers une bibliothèque spectrale de contrôle positif. Ensuite, tous les spectres à partir des images de contrôle négatif est soustrait de la bibliothèque spectrale du contrôle positif afin d'améliorer la spécificité (réduire les faux positifs). La bibliothèque spectral filtré résultant est considéré comme le RSL qui sert à l'analyse des matériaux d'intérêt. Tous les échantillons de tissus sont soumis à un même processus de formation d'image sont mis en correspondance et contre la RSL. L'image résultante contiendra seulement dans des zones avec des éléments d'intérêt sur un fond noir. Cette image pourrait alors être analysé avec ImageJ en utilisant ses fonctions de seuil et d'analyse de particules pour obtenir la zone de particules cartographiés par champ de vision. Les données numériques obtenues à partir de ImageJ peuvent être exportationed à une feuille de calcul pour une analyse ultérieure.
Il est important de considérer que les échantillons biologiques sont intrinsèquement différents les uns des autres, et les méthodes de coloration peuvent affecter la visualisation par EDFM et HSI, les paramètres d'exposition doivent être déterminés conformément à ce que produit la meilleure image de contraste élevé pour un type spécifique de l'échantillon. Bien que la réduction des faux positifs peut être obtenue par la filtration de bibliothèques de spectres, il est crucial d'obtenir des témoins négatifs fiables qui ont évité la contamination par l'élément d'intérêt, comme des spectres correspondant à cette contamination pourrait être filtré à partir de la bibliothèque spectrale du contrôle positif , l'augmentation des taux de faux négatifs. En outre, la gamme d'intensité du spectre qui est détectable avec le logiciel d'imagerie hyperspectrale ne peut pas dépasser la limite du logiciel particulier (pour cette étude, qui est de 16.000 unités): zones avec un nombre élevé de particules accumulées qui produisent spectral intensités supérieures à la limite d'intensité sont laissés hors de la bibliothèque spectrale, en raison du risque d'augmenter le nombre de faux négatifs.
Bien que le système HSI confère de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, il ya quelques inconvénients et limitations à considérer. La première est que la grande quantité de données optiques recueillies peuvent nécessiter une puissance de calcul importante. Une autre est que HSI peut être temps-intensive, en particulier aux premiers stades lorsque les bibliothèques spectrales de référence sont en cours de création. En outre, le temps d'imagerie peut nécessiter plusieurs minutes par la capture d'image, ce qui rend plus lent que l'imagerie à fond noir simples; cependant, il est encore plus rapide que d'effectuer la préparation des échantillons et visualisation par microscopie électronique. En outre, les systèmes complexes peuvent entraîner de multiples spectres caractéristiques, qui nécessitent le développement des contrôles hautement spécialisés et font la mise en place de standards, bibliothèques de référence universelles difficiles 26. Enfin, la technologieRésultats nique en résolution inférieure à celle des techniques Probe- ou microscopie électronique, telles que la microscopie à force atomique ou microscopie électronique en transmission, qui peuvent résoudre des atomes individuels. La résolution de cette technique est limitée en raison de sa nature photonique, ce qui l'empêche d'être un outil de haute précision pour la mesure des tailles de particules à l'échelle du nanomètre ou pour localiser précisément les matériaux à un niveau sous-micron. Bien que la technique peut être en mesure d'identifier des particules au sein de certains compartiments de tissus ou organites cellulaires supérieur à 1 pm (tels que des noyaux de cellules), petits organites ou caractéristiques sont difficiles à visualiser avec précision avec cette méthode. A noter également, compte tenu de sa résolution spatiale, cette méthode ne peut pas différencier entre les nanoparticules et simples agglomérats 11.
D'autres considérations incluent: certains matériaux (comme les métaux nobles) ont une réflectance beaucoup plus élevé et profils spectrales distinctes, ce qui peut les rendre plus faciles à analyze et carte spectrale avec cet outil. D'autres, tels que les oxydes semi-métalliques étudiés dans cette étude et des nanomatériaux à base de carbone 24, 27, peut-être plus difficile en raison de leur composition élémentaire, la forme, et en fonction de la matrice. Dans deux études d'inhalation murins par Mercer et al., Un système similaire à celui utilisé dans cette étude a été utilisé afin de localiser les nanotubes de carbone dans les poumons et dans les organes secondaires en fonction de leur remarquablement élevé contraste avec les tissus environnants. Cependant, la cartographie hyperspectrale n'a pas été démontrée dans deux études, probablement parce que la forme unique de fibres de carbone était un trait suffisante pour une identification. Une autre considération a trait spécifiquement aux tissus: depuis le dépôt de nanoparticules d'intérêt à des organes spécifiques à travers des processus biophysiques normales est imprévisible (et souvent elle-même l'objet de l'étude), la détermination d'un contrôle positif applicable peut être difficile et exige un examen de la façon dont la génération de la commande might affecter l'état d'un matériau d'intérêt. Par exemple, si une bibliothèque spectrale est créée à partir de nanoparticules cristallines d'intérêt, il peut être difficile de cartographier la bibliothèque pour ces mêmes nanoparticules dans les tissus ou cellules en raison de changements dans les spectres résultant de l'altération de la particule (par exemple, en raison de changer le pH, la dissolution, l'agglomération, la liaison aux protéines) et le micro-environnement global ou matrice. Enfin, la technique est limitée par sa nature semi-quantitative: il peut seulement être aussi quantitative que d'autres techniques de microscopie à deux dimensions de la résolution semblable, ce qui signifie qu'il ne peut pas être facilement utilisé pour réaliser des tâches telles que la caractérisation de la charge d'organes totale d'un matériau.
Dans l'ensemble, EDFM HSI et fournissent plusieurs avantages par rapport nanomatériau imagerie et de caractérisation des techniques classiques, telles que TEM, et HAADF DIC. EDFM / HSI permet plus rapide acquisition et d'analyse d'image, ce qui permet d'économiser du temps et de coût par rapport aux conven plus intensivetechniques supplémentaires. En outre, la préparation de l'échantillon pour EDFM / IHV est généralement à la fois minimale et non destructive, ce qui économise du temps et permet également une analyse plus souple d'un échantillon donné, car il peut alors être utilisé pour d'autres techniques. En outre, HSI est souple, ce qui permet l'analyse des matériaux à l'échelle nanométrique de nombreuses compositions et dans une variété de matrices. L'équipe de recherche travaille à affiner la méthode décrite ici pour d'autres matériaux et les types d'échantillons, y compris une évaluation en profondeur de la spécificité de la technologie. Une prochaine étape cruciale sous enquête par l'équipe de recherche est la validation de ces techniques par rapport aux normes d'or traditionnelles (par exemple, Raman, TEM, SEM) pour les matériaux et les types d'intérêt de tissus.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
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