تحديد أكسيد المعادن النانوية في العينات النسيجية من خلال تعزيز بمجهر ذي ساحة مظلمة المجهري الطيفي ورسم الخرائط
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
كما تستخدم المواد متناهية الصغر على نحو متزايد في مجموعة متنوعة من الصناعات والتطبيقات، وهناك حاجة للتصوير النانو وتوصيف الطرق التي هي أكثر سرعة، وبأسعار معقولة، ومريحة من الطرائق التقليدية، مثل المجهر الإلكتروني. لتصور جسيمات متناهية الصغر (NP) التفاعل مع الخلايا والأنسجة، والأنظمة الحية، وقد استخدمت العديد من التقنيات البصرية، بما في ذلك على النقيض تدخل الفرق (DIC) المجهري 1 والنهج الميداني زائل، مثل الانعكاس الكلي الداخلي (TIR) أو القريب المجهر المجال البصري (NSOM) 2،3. ومع ذلك، وهذه هي المناهج التحليلية الراقية، بعيدا عن متناول معظم المختبرات غير المتخصصين 4. المجهر الإلكتروني، بما في ذلك انتقال المجهر الإلكتروني (TEM)، كما تم استخدامها لدراسة NP التفاعل مع الخلايا 5،6،7،8. وقد استخدم عالية زاوية الحلقي الساحة المظلمة (HAADF) المجهر الإلكتروني النافذ لدراسة التفاعل مصادر القدرة النوويةمع فيروسات 9. المجهر متحد البؤر هو أسلوب آخر شعبية تستخدم لدراسة التفاعلات NP-10 خلية.
في السنوات الأخيرة، وقد استخدمت التصوير الطيفية (HSI) التقنيات المعتمدة الساحة المظلمة كأداة تحليلية واعدة لدراسة المصادر في المصفوفات البيولوجية 11. نظم HSI تولد تمثيل ثلاثي الأبعاد للبيانات المكانية والطيفية، والمعروفة باسم المكعب الزائدي أو datacube 12. يتم استخدام الخريطة المكانية من التباين الطيفي لتحديد مادية. يمكن أن تتولد لمحات طيفية من المواد المعروفة وتستخدم مكتبات مرجعية للمقارنة عينات مجهولة. واحدة من المزايا الرئيسية مع أنظمة HSI هو قدرته على الجمع بين التصوير مع التحليل الطيفي، وبالتالي تأسيس الموقع وتوزيع تلك المصادر غير معروفة في الجسم الحي أو خارج الجسم فضلا عن ربطها الجسيمات إشارة أخرى من المعروف، تركيبة مشابهة.
هناك العديد من المزايا للاستخدام نظم HSI على تقنيات التصوير التقليدية: مطلوب الحد الأدنى من إعداد العينة. إعداد العينات عادة غير المدمرة في الطبيعة؛ الحصول على الصور والتحليل هو أسرع؛ تقنية تقدر ب 13 فعالية من حيث التكلفة. والتوزيع المكاني وتحليل المركبات من تكوين مختلطة و / أو في مصفوفات معقدة يتم إنجاز أكثر سهولة 14.
للبحث المواد متناهية الصغر التي تنطوي على العينات الثمينة، واحدة من أهم الاعتبارات هو توافر طريقة التصوير غير المدمرة، والذي يسمح للالقدرة على فحص عينات مرارا وتكرارا من قبل وسائل واحد أو أكثر. المتكرر أو قد يكون المطلوب تحليلات متعددة لتطوير قواعد البيانات الشاملة التي لن تكون متاحة من أسلوب واحد. في هذا الصدد، ودراسة خصائصه البصرية هو الطريق الأسلم لتحليل العينة. باستخدام المجهر تعزيز الساحة المظلمة (EDFM) ونظام HSI لدراسة استجابة البصرية من العينة – وهي reflectance، ولكن أيضا الامتصاصية والنفاذية – تحديد وتوصيف ميزة لا يمكن أن يؤديها 15. وتشمل النقاط النهائية توصيف المحتملة تقييما لحجم وشكل الجسيمات النانوية أو تكتلات وتوزيع الجسيمات النانوية داخل عينة النسبي.
في هذه الورقة، ونحن تصف أساليب رسم الخرائط خصيصا لجزيئات أكسيد المعادن في الأنسجة بعد الوفاة باستخدام نظام HSI بناء على خوارزمية مباراة بكسل الطيفي يشار إلى مخطط زاوية الطيفي (SAM). لقد اخترنا هذا تطبيق معين لأنه لديه القدرة على استكمال الحالية والمستقبلية في مجال البحوث nanotoxicology الجسم الحي، حيث يتم استخدام نماذج حيوانية لتقييم الآثار الصحية الناجمة عن التعرض للمواد النانوية المهندسة. يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضا بإبلاغ النانو الأبحاث توصيل العقاقير التي تستخدم الأنسجة الحيوانية أو النماذج. ولا سيما، وامتصاص جسيمات متناهية الصغر، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، وإفراز طوال سيمكن أن يتم التحقيق rgans والأنسجة مع هذا النظام. ويجري التحقيق مجموعة واسعة من التطبيقات لاستخدامها في البحوث الطبية الحيوية 11.
هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم العينات البيولوجية المختلفة (مثل الأنسجة المختلفة الأنواع، وعينات غسيل القصبات، ومسحات الدم) التي تعرضت لالنانوية من مجموعة متنوعة من التراكيب عنصري 16-19. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة مفيدة لدراسة جسيمات متناهية الصغر biodistribution في الجسم الحي في المختبر، والتي هي وثيقة الصلة للدراسات تسليم النانو المخدرات 11. ما وراء العينات البيولوجية، EDFM وHSI يمكن استخدامها لتقييم النانوية في العينات البيئية، مثل مياه الصرف الصحي 20. تقييم التعرض المهني يمكن أن يتيسر من خلال استخدام هذه التقنية أيضا، لأنها يمكن أن تستخدم لتقييم فعالية معدات الوقاية الشخصية في منع اختراق جسيمات متناهية الصغر. وعلاوة على ذلك، والشركة المصرية للاتصالات البحوثصباحا حاليا على وضع EDFM مماثل وبروتوكول HSI لتقييم عينات سائل الاعلام فلتر الجسيمات النانوية التي تم جمعها من عمليات تقييم التعرض المهني. في حين إعداد هذه الأنواع عينة مختلفة عن EDFM وHSI قد تختلف، فمن المهم أن يتم إعداد في مثل هذه الطريقة التي يمكن تصور بسهولة من قبل النظام البصري. عادة، يجب أن تكون على استعداد العينة كما لو أن تصور ذلك عن طريق الفحص المجهري brightfield التقليدية. هناك العديد من أنظمة التصوير الطيفية المتاحة تجاريا 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
ليمكن تحقيق عينات الأنسجة التي خضعت تلطيخ النسيجية التقليدية، وتحديد وتحليل جزيئات أكسيد المعدن من خلال مزيج من EDFM، ورسم الخرائط HSI، وتقنيات تحليل الصور. في حين أن هناك مرونة في إعداد العينات لالأنسجة أو المناعية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام الأنسجة الثابتة أو تجميدها؛ نوع من وصمة عار)، فمن المهم أن العينات مقطوع لسمك 5-10 ميكرون التصور الأمثل. وكانت العينات المستخدمة هنا الثابتة الفورمالين وقبل باجتزاء مع مشراح الدوارة إلى 6 ميكرون سمك جزءا لا يتجزأ من البارافين، التي شنت على شرائح المجهر الزجاجية، ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين وcoverslipped. تم استخدام أنسجة الجلد الخنازير من الجلدي التعاون فيفو السابقين اختراق السموم لهذه الدراسة. تعرضت أنسجة لجزيئات أكسيد المعادن (الألومينا والسليكا وceria) في تعليق مائي. الكشف عن المنطقة (ق) من الفائدة (التباين العالي إيليمياليلة) مع EDFM هو الخطوة الأولى الحاسمة التي تسهل رسم الخرائط HSI لاحق والتحليل. يجب تصوير عينات السيطرة الإيجابية والسلبية وتحليلها أولا من أجل إنشاء مكتبة الطيفية لتكون مرجعا. ويتم تصدير الأطياف التي تم جمعها من السيطرة الإيجابية لمراقبة إيجابية مكتبة الطيفية. ثم، يتم طرح جميع الأطياف من الصور سيطرة سلبية من مكتبة الطيفية مراقبة إيجابية من أجل تحسين نوعية (لحد من ايجابيات كاذبة). ويعتبر الناتج تصفيتها مكتبة الطيفية RSL يخدم لتحليل المواد المثيرة للاهتمام. جميع عينات الأنسجة الخضوع لعملية التصوير نفسها، ويتم تعيين ضد RSL. فإن الصورة الناتجة تحتوي على المناطق الوحيدة مع عناصر من الفوائد على خلفية سوداء. ويمكن بعد ذلك بتحليل هذه الصورة مع يماغيج باستخدام وظائف العتبة وتحليل الجزيئات من أجل الحصول على مجال الجزيئات المعينة في مجال الرؤية. البيانات الرقمية التي تم الحصول عليها من يماغيج يمكن أن يكون التصديرإد إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
من المهم أن نعتبر أن كعينات البيولوجية تختلف بطبيعتها عن بعضها البعض، وأساليب تلطيخ قد تؤثر على التصور من خلال EDFM وHSI، ينبغي تحديد إعدادات التعرض وفقا لما ينتج أفضل صورة التباين العالي لنوع معين من العينة. على الرغم من أن الحد من ايجابيات كاذبة يمكن أن يتحقق من خلال الترشيح المكتبات الطيفية، فمن الأهمية بمكان الحصول على ضوابط السلبية الموثوق بها التي تجنبت التلوث مع عنصر المصلحة، كما الأطياف المقابلة لهذا التلوث المحتمل أن تتم تصفيته من مكتبة الطيفية السيطرة الإيجابية ل ، وزيادة معدلات سلبية كاذبة. أيضا، ومجموعة كثافة الطيف الذي يمكن كشفها مع برنامج التصوير الطيفية لا يمكن أن يتجاوز الحد الأقصى للبرنامج معين (على هذه الدراسة، وهذا هو 16000 وحدة): المناطق مع عدد كبير من الجزيئات المتراكمة التي تنتج ليرة سوريةيتم ترك شدة ectral فوق الحد كثافة من المكتبة الطيفية، نظرا لخطر زيادة عدد من السلبيات كاذبة.
في حين أن النظام HSI يمنح مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية، هناك بعض السلبيات وأوجه القصور للنظر فيها. واحد هو أن كمية كبيرة من البيانات البصرية التي تم جمعها قد تتطلب قوة الحوسبة كبيرة. آخر هو أن HSI يمكن أن يكون الوقت كثيفة، وخاصة في المراحل الأولى عندما يتم خلق مرجعية المكتبات الطيفية. أيضا، قد تتطلب وقتا التصوير عدة دقائق في التقاط الصور، مما يجعلها أبطأ من التصوير الساحة المظلمة بسيط. ومع ذلك، فإنه لا يزال أسرع من أداء إعداد العينات والتصور بواسطة المجهر الإلكتروني. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الأنظمة المعقدة في أطياف مميزة متعددة، والتي تتطلب وضع ضوابط درجة عالية من التخصص وجعل إنشاء موحدة والمكتبات مرجعية عالمية صعبة (26). وأخيرا، فإن التكنولوجياالنتائج يت ضمن في دقة أقل من التقنيات probe- أو الإلكترون المجهري، مثل مجهر القوة الذرية أو انتقال المجهر الإلكتروني، والتي يمكن حل ذرات الفردية. القرار هذا الأسلوب هو محدود نظرا لطبيعتها الضوئية، والذي يمنع من أن يكون أداة عالية الدقة لقياس أحجام الجسيمات على مستوى النانومتر أو لتحديد بدقة المواد على مستوى ميكرون الفرعية. في حين أن التقنية قد تكون قادرة على تحديد جزيئات معينة داخل المقصورات الأنسجة أو العضيات الخلوية أكبر من 1 ميكرون (مثل نواة الخلية)، العضيات أصغر أو ميزات تشكل تحديا لتصور بدقة مع هذا الأسلوب. ومن الجدير ذكره، نظرا القرار المكانية، ويمكن هذا الأسلوب لا تفرق بين الجسيمات النانوية واحدة وتكتلات 11.
وتشمل الاعتبارات الأخرى: بعض المواد (مثل المعادن النبيلة) لديها أعلى بكثير الانعكاس وملامح طيفية مميزة، والتي يمكن جعلها أسهل للanalyزي وخريطة طيفيا مع هذه الأداة. آخرون، مثل أكاسيد شبه لامع التحقيق في هذه الدراسة والمواد النانوية الكربونية 24، 27، قد يكون أكثر صعوبة بسبب من عناصر تكوينها، والشكل، واعتمادا على المصفوفة. في دراستين استنشاق الفئران التي ميرسر وآخرون، تم استخدام نظام مماثل لتلك التي استخدمت في هذه الدراسة من أجل تحديد موقع أنابيب الكربون النانوية في الرئة وأجهزة الثانوية على أساس التباين العالي بشكل ملحوظ مع الأنسجة المحيطة بها. ومع ذلك، لم يكن أظهر رسم الخرائط الطيفية في أي دراسة، من المحتمل بسبب شكل فريد من ألياف الكربون كان سمة كافية لتحديد الهوية. وهناك اعتبار آخر ويتعلق على وجه التحديد إلى الأنسجة: منذ إيداع النانوية التي تهم أجهزة معينة من خلال عمليات فيزيائية حيوية طبيعية لا يمكن التنبؤ بها (وغالبا في حد ذاته موضوع الدراسة)، ويمكن تحديد عنصر تحكم الإيجابية التي تنطبق يكون صعبا ويتطلب النظر في كيفية توليد سيطرة مآيت تؤثر على حالة المواد المثيرة للاهتمام. على سبيل المثال، إذا تم إنشاء مكتبة الطيفية من الجسيمات النانوية البكر من الفائدة، قد يكون من الصعب رسم خريطة للمكتبة لنفس تلك الجسيمات النانوية في الأنسجة أو الخلايا نتيجة للتغيرات في أطياف الناتجة عن تغيير في الجسيمات (على سبيل المثال، وذلك بسبب تغيير في درجة الحموضة، وانحلال، والتكتل، بروتين ملزمة) والمكروية العامة أو المصفوفة. وأخيرا، فإن تقنية محدودة في طبيعتها شبه الكمية: أنه يمكن أن يكون إلا الكمي مثل تقنيات المجهر ثنائي الأبعاد الأخرى لقرار مماثل، مما يعني أنه لا يمكن استخدامها بسهولة لأداء مهام مثل تميز عبء الجهاز الكلي للمادة.
عموما، EDFM وHSI توفير العديد من المزايا التصوير المواد متناهية الصغر وتوصيف التقنيات التقليدية، مثل TEM، HAADF ومدينة دبي للإنترنت. EDFM / HSI يسمح لسرعة الحصول على الصور وتحليلها، مما يوفر الوقت والتكلفة بالمقارنة مع أكثر conven مكثفةتقنيات tional. بالإضافة إلى ذلك، وإعداد العينات لEDFM / HSI هو عادة كل من الحد الأدنى وغير مدمرة، مما يوفر الوقت ويسمح أيضا لتحليل أكثر مرونة من عينة نظرا لأنه قد ثم استخدامها لتقنيات أخرى. وعلاوة على ذلك، HSI هي متعددة، مما يسمح لتحليل المواد النانومترية الحجم من العديد من المؤلفات ومجموعة متنوعة من المصفوفات. ويعمل فريق البحث لتحسين الطريقة الموصوفة هنا لمواد أخرى وأنواع العينات، بما في ذلك تقييم متعمق لخصوصية هذه التكنولوجيا. والخطوة القادمة حاسمة قيد التحقيق من قبل فريق البحث هو التحقق من صحة هذه التقنيات ضد معايير الذهب التقليدية (على سبيل المثال، رامان، TEM، SEM) للمواد وأنواع الأنسجة من الاهتمام.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
References
- Sun, W., et al. Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy. Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).
- Anselme, K., et al. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Anshup, A., et al. Growth of gold nanoparticles in human cells. Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).
- Weinkauf, H., et al. Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae. Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).
- Sondi, I., et al. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria. J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).
- Berry, C. C. Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications. J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).
- Chithrani, B. D., et al. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).
- Chithrani, B. D., et al. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV 1. J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).
- Carlson, C., et al. Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species. J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).
- Roth, G. A., et al. Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).
- Williams, P., et al. Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis. Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).
- Ziph Schatzberg, L. Hyperspectral imaging enables industrial applications. Industrial Photonic. , (2014).
- Sun, D. W. . Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro. , (2010).
- ElMasry, G., et al. Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry. J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).
- Mortimer, M., et al. Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa. Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).
- Sarlo, K., et al. Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat. Toxico. 263, 117-126 (2009).
- Husain, M., et al. Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation. Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).
- Meyer, J. N., et al. Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan. Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).
- Badireddy, A. R., et al. characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy. Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).
- Dettmeyer, R. F. . Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives. , 370 (2011).
- Titford, M. Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology. J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).
- Kumar, G. L. . Special stains and H&E. , (2014).
- Manolakis, D., et al. Hyperspectral image processing for automatic target detection applications. Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).
- Mercer, R. R., et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21 (2011).
- Kim, M. S., et al. Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety. T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).
