This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
Una de las observaciones más estimulantes en evolución de las plantas es una correlación entre la ocurrencia del campo geomagnético (GMF) reversiones (o excursiones) y el momento de la radiación de las angiospermas. Esto condujo a la hipótesis de que las alteraciones en GMF polaridad pueden desempeñar un papel en la evolución de las plantas. Aquí se describe un método para poner a prueba esta hipótesis mediante la exposición de Arabidopsis thaliana que invierte artificialmente condiciones GMF. Se utilizó un magnetómetro de tres ejes y los datos obtenidos se utilizaron para calcular la magnitud del GMF. Tres fuentes de alimentación de CC se conectan a tres pares de bobinas de Helmholtz y eran controlados por una computadora para alterar las condiciones GMF. Las plantas cultivadas en placas de Petri fueron expuestos a tanto normales como invierten condiciones GMF. También se realizaron experimentos de exposición simulada. Plantas expuestas fueron fotografiados durante el experimento y las imágenes fueron analizadas para calcular la longitud de la raíz y las áreas de las hojas. ARN total fue extraído de Arabidopsis y cuantitativaTime-PCR real (qPCR) se realizaron análisis de la expresión génica de cruciferina 3 (CRU3), protein1 transporte de cobre (COTP1), Redox Responsive Transcripción factor1 (RRTF1), Fe superóxido dismutasa 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), tilacoidales ascorbato peroxidasa (TapX), un ascorbato citosólica Peroxidase1 (APX1), y NADPH / respiratoria proteína estallido oxidasa D (RbohD). Se analizaron cuatro genes de referencia diferentes para normalizar los resultados de la qPCR. El mejor de los cuatro genes fue seleccionado y se utilizó el gen más estable para la normalización. Nuestros datos muestran por primera vez que invirtiendo la polaridad GMF utilizando bobinas triaxiales tiene efectos significativos en el crecimiento de plantas y la expresión génica. Esto apoya la hipótesis de que GMF reversión contribuye a inducir cambios en el desarrollo de plantas que podrían justificar una mayor presión selectiva, llevando eventualmente a pevolución lant.
El campo magnético de la Tierra (o equivalentemente el campo geomagnético, GMF) es un factor ambiental ineludible para todos los organismos vivos en el planeta, incluyendo las plantas. El GMF siempre ha sido una característica natural de la Tierra, por lo que durante la evolución, todos los organismos vivos experimentado su acción. Un creciente cuerpo de evidencia muestra que el GMF es capaz de influir en muchos procesos biológicos 1. El GMF no es uniforme y hay diferencias locales significativos en su magnitud y dirección en la superficie de la Tierra. El GMF en la superficie de la Tierra muestra una amplia gama de magnitudes, que van desde menos de 30 mT a casi 70 mT. El GMF protege a la Tierra y su biosfera de los efectos letales de viento solar al desviar la mayor parte de sus partículas cargadas a través de la magnetosfera 2.
Las plantas responden a los estímulos del medio ambiente; y las respuestas clásicas a factores abióticos como la luz y la gravedad han sido thoroughly descrito mediante la definición de las denominadas respuestas fototrópicos y gravitrópica. Muy poco, o nada, que se conoce sobre los mecanismos de la percepción y las respuestas de las plantas a los campos magnéticos, a pesar de la gran cantidad de trabajos publicados sobre este tema y recientemente revisados 1. A diferencia del campo gravitatorio, el GMF cambió consistentemente durante la evolución planta que representa por lo tanto un importante factor estrés abiótico que ha sido considerado recientemente una fuerza impulsora potencial con el tiempo que contribuye a plantar la diversificación y la especiación 2. Reversiones geomagnéticas (o excursiones) son los cambios en la polaridad de la GMF. Durante la historia de vida de la Tierra, las reversiones GMF ocurrieron varias veces. Estos expuestos al planeta a periodos de menor resistencia GMF durante cada transición de polaridad. Algunos autores han planteado la hipótesis de que estas transiciones períodos de baja resistencia GMF podrían haber permitido a las radiaciones ionizantes del viento solar para llegar a la superficie de la Tierra, lo que induce unatensión constante a los organismos vivos, lo que podría haber sido lo suficientemente fuerte como para inducir alteraciones genéticas que finalmente llevan a plantar evolución 2.
Un análisis detallado de los experimentos que describen los efectos de los campos magnéticos sobre las plantas muestran un gran número de informes contradictorios, que se caracteriza por la escasez de mecanismos plausibles interacción biofísicos. Muchos experimentos son simplemente poco realista, mientras que otros carecen de una hipótesis comprobable y, en definitiva, no son convincentes 3. En los últimos años, el progreso y el estado de la investigación sobre el efecto de los campos magnéticos en la planta se ha revisado 2,4-11. Recientemente, el efecto del campo magnético de baja y alta se ha discutido a fondo 1, con un enfoque particular en la participación de eventos de reversión GMF en evolución de las plantas 2.
Los medios más directos para fundamentar la hipótesis de que las inversiones de GMF afectan evolución de las plantas es sintetizar un GMFreversión en el laboratorio mediante pruebas de la respuesta de las plantas a las condiciones normales de campo magnético y invertidos. Para probar la hipótesis, por lo tanto, construimos una bobina de Helmholtz-pares campo magnético sistema octogonal triaxial compensación (bobinas triaxiales), que es capaz de revertir con precisión las condiciones normales GMF.
Se utilizó Arabidopsis thaliana como planta modelo y probamos el efecto de revertido GMF sobre la expresión génica de algunos genes importantes: cruciferina 3 (CRU3), que codifica una proteína de almacenamiento 12S semilla que es tirosina fosforilada y su estado de fosforilación se modula en respuesta a ABA en semillas de Arabidopsis thaliana 12,13; Transporte protein1 de cobre (COTP1), que codifica una proteína de la superfamilia de transporte de metales pesados / desintoxicación con la función predominante en la adquisición de Cu suelo y el desarrollo del polen 14; y Redox Responsive Transcripción factor1 (RRTF1),que codifica un miembro de la ERF (factor de respuesta de etileno) subfamilia B-3 de la familia del factor de transcripción ERF / AP2 que contiene un dominio AP2 que facilitan la co-activación sinérgica de las vías de la expresión génica y confiere tolerancia cruzada a abiótico y biótico subraya 15.
Por otra parte también se analizó cinco genes implicados en las respuestas de estrés oxidativo: Fe superóxido Dismutase1, (FSD1), que codifica una enzima citoplasmática que enzimáticamente y rápidamente convierte el anión superóxido (O 2 -) y agua (H 2 O) a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y oxígeno molecular (O2) 16; Catalase3 (CAT3), que codifica y que enzima que cataliza la descomposición de H 2 O 2 en agua y oxígeno 17,18; tilacoidales ascorbato peroxidasa (TapX), que codifica una peroxidasa tilacoide cloroplástica que neutraliza H2O2 19; ascorbato Peroxidase1 (APX1), que codifica una peroxidasa citosólica que neutraliza H 2 O 2 y representa uno de los posibles objetivos de las modificaciones post-traduccionales mediadas por moléculas derivadas-NO 20; y NADPH-oxidasa estallido respiratorio proteína D (RbohD) que codifica una enzima que genera O 2 – y juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento, el desarrollo y las respuestas de estrés en Arabidopsis 21.
Nuestra metodología de campo-reversión proporciona la primera evidencia de que GMF reversión puede inducir un cambio significativo en la morfología y la expresión génica de A. raíces y brotes thaliana. Este protocolo proporciona una forma innovadora de evaluar el efecto de reversión en GMF morfología de la planta y la expresión génica y se puede utilizar para evaluar el efecto potencial de GMF reversión en otros aspectos del comportamiento de la planta, y de este modo guiar la discusión de la role de GMF reversión en la evolución de las plantas.
Recientemente hemos demostrado que existe una correlación sorprendente entre las inversiones GMF y el momento en que la desviación de la mayoría de los linajes familiares Angiospermas produjo 2. Sin embargo, a pesar de las hipótesis estimulantes y la gran cantidad de estudios sobre el efecto de variadas intensidades GMF, la suposición de que GMF reversión puede en sí inducir cambios significativos en la expresión de genes de plantas y morfología nunca se ha demostrado. Aquí nos muestran por primera vez, un método que utiliza una bobina de Helmholtz octogonal triaxial para revertir GMF en nuestro laboratorio, y que la inversión del campo magnético ambiental puede causar cambios fenotípicos y la modulación de la expresión génica en las plantas.
A fin de obtener GMF reversión (o modificación) en un volumen suficiente para los experimentos de crecimiento de las plantas (2 x 2 x 2 m 3), hemos construido un sistema de bobina de Helmholtz octogonal. Este sistema no está disponible comercialmente (bobinas de Helmholtz están generalmente en forma de anillo y más pequeño)y los costos para la construcción fueron considerables. Es importante destacar que este sistema ofrece la modificación del campo robusta, con el tiempo-estabilidad y homogeneidad excepcional en los campos magnéticos modificados.
El sistema está diseñado y construido para reducir el valor de la GMF a una milésima parte de las condiciones normales o revertir cualquiera de las tres dimensiones del campo magnético. Sin embargo, el diseño de las bobinas no permite generar una alta intensidad de campo magnético. Por lo tanto, este instrumento en la forma actual no es adecuado para los experimentos diseñados para evaluar el efecto de la alta intensidad del campo magnético en las plantas u otros organismos.
En el laboratorio, la alteración de la GMF similares a los descritos en este método se ha obtenido por diferentes métodos, incluyendo blindaje rodeando la zona experimental por placas metálicas ferromagnéticas con alta permeabilidad magnética, que se desvían los campos magnéticos y se concentran en el seno del propio metal. The ventaja de utilizar bobinas de Helmholtz es que el sistema permite que las plantas sean expuestos a condiciones más naturales (luz, de circulación de aire, etc.), por lo que es ideal no sólo para los estudios in vitro (como con el uso de placas de Petri), sino también en vivo crecimiento de las plantas y los experimentos de desarrollo. Las dimensiones de nuestro sistema de crear un espacio que permita la supresión de hasta <1 / 1.000 de la GMF natural a lo largo de 25 x 25 x 25 cm 3 volumen esférico (ver Figura 1 A), lo que permite acoger varias placas de Petri o algún pequeño ollas para el crecimiento vegetal.
El método que aquí se presenta se ha aplicado a estudios de biología vegetal; Sin embargo, el sistema permite una amplia gama de experimentación, incluyendo virología y microbiología, así como los estudios sobre los nematodos (por ejemplo, Caenorhabditis elegans), artrópodos y animales pequeños (incluyendo ratones y ratas). Por lo tanto, las pruebas de la hipótesis de que la inversión de la GMF es capazpara inducir cambios morfológicos y transcripcionales también podrían extenderse a muchos otros sistemas vivos, tal vez en última instancia, incluso a las células humanas.
El GMF está en constante cambio y fluctuante. Por lo tanto, en nuestros experimentos Un desafío importante es proporcionar una compensación constante de la GMF el fin de obtener los nuevos valores GMF deseados. Esto sólo se puede lograr mediante un control continuo de valores de los campos magnéticos a través de la lectura de los valores del magnetómetro y compensación de voltaje. Por lo tanto, el sistema puede compensar la parte que varía lentamente de la GMF pero no hace nada por las fluctuaciones de frecuencia más alta.
En conclusión, el uso de bobinas triaxiales para invertir el vector GMF fue fundamental para demostrar que esta inversión de la GMF vector es capaz de inducir cambios morfológicos de plantas y la expresión génica diferencial. Los resultados obtenidos con el método presentado proporcionan una evidencia convincente en apoyo de la hipótesis de que la re GMFversales podrían haber sido una de las fuerzas motrices de la evolución de plantas en escalas de tiempo geológicas 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |