자기장 (GMF)과 식물 진화 : GMF 반전의 효과에 대한 조사<em> 애기 장대</em> 개발 및 유전자 발현
Summary
This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
Abstract
식물 진화 가장 자극 관측 중 하나는 자기장의 발생 (GMF) 역전 (또는 여행) 및 피자 식물 방사선의 모멘트 사이의 상관 관계이다. 이것은 GMF 극성의 변화가 식물 진화 역할을하는 가설되었다. 여기서는 GMF 인위적 조건을 반전하는 애기 장대를 노출시켜이 가설을 검증하는 방법을 설명한다. 우리는 3 축 자력계를 사용하여 수집 된 데이터는 GMF의 크기를 계산하는 데 사용 하였다. 세 개의 DC 전원 공급 장치는 세 개의 헬름홀츠 코일 쌍에 접속하고, GMF 조건을 변경하는 컴퓨터에 의해 제어했다. 페트리 접시에서 자란 식물은 모두 정상에 노출 GMF 조건을 반전했다. 가짜 노광 실험도 수행 하였다. 노출 된 식물을 실험 기간 동안 촬영 된 이미지는 루트 길이와 잎 면적을 계산하기 위해 분석 하였다. 애기 장대 총 RNA를 추출하여 정량적이었다실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)는 CRUCIFERIN 3 (CRU3), 구리 수송 protein1 (COTP1), 산화 환원 응답 전사 Factor1 (RRTF1), 철 수퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (1), (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal의 유전자 발현에 대한 분석을 수행 하였다 아스코르브 산염 퍼 옥시 다제 (TAPX), 세포질 아스코르브 Peroxidase1 (APX1), 및 NADPH / 호흡기 버스트 산화 효소 단백질 D (RbohD). 네 가지 기준 유전자 qPCR의 결과를 정규화하기 위해 분석 하였다. 네 가지 유전자의 최상의 선택하고, 정규화를위한 가장 안정한 유전자를 사용 하였다. 우리의 데이타는 코일을 사용하는 축 GMF의 극성을 반전하면 식물 성장 및 유전자 발현에 중요한 효과를 가지고 있음을 최초로 보여준다. 이것은 결국 P 선도, 더 높은 압력이 선택을 정당화 할 수 GMF 반전 식물 발달 변화를 유도에 기여 가설을 지원LANT 진화.
Introduction
지구의 자기장 (또는 동등 자기장, GMF)은 식물을 포함하여 지구상에 살고있는 모든 생물에 대한 피할 수없는 환경 적 요인이다. GMF는 항상 지구의 자연적인 기능을하고있다, 이렇게 진화하는 동안, 모든 살아있는 유기체는 행동을 경험했다. 증거 증가 체 GMF 여러 생물학적 과정에 영향을 미치는 1 수 있다는 것을 보여준다. GMF는 균일하지 않고 지구의 표면에서의 크기와 방향에 상당한 로컬 차이가있다. 지구 표면에서 GMF 미만 30 μT에서 약 70 μT에 이르기까지, 크기의 넓은 범위를 보여줍니다. GMF는 자기권 2를 통해 대전 된 입자의 대부분을 편향에 의해 태양풍의 치명적인 영향으로부터 지구와 생태계를 보호합니다.
식물은 환경 적 자극에 반응; 이러한 빛과 중력과 같은 비 생물 적 요소에 고전적인 반응은 T왔다horoughly 소위 phototropic gravitropic 및 응답을 정의하여 설명했다. 거의, 또는 아무것도,이 주제에 대한 발표와 최근 1 검토 서류의 과다에도 불구하고, 지각과 자기장에 식물의 반응의 메커니즘에 알려져있다. 중력장과는 달리, GMF하여 최근 다양 화와 분화 2 공장에 기여 결국 잠재적 인 원동력으로 간주 된 중요한 비 생물 적 스트레스 요인을 나타내는 식물 진화하는 동안 지속적으로 변경되었습니다. 지자기 역전 (또는 여행)는 GMF의 극성의 변화이다. 지구 생명의 역사 동안, GMF 반전이 여러 번 발생했습니다. 이 모든 극성 전환하는 동안 감소 GMF 강도의 기간에 지구를 노출. 낮은 강도의 GMF이 천이 기간이 유도되어, 지구 표면에 도달하는 태양 바람 전리 방사선 허용 할 수 있다는 몇몇 저자 가정 한진화 2 공장 선도 결국 유전자의 변화를 유도하기에 충분히 강한 수 있었다 살아있는 유기체에 일관성 스트레스.
식물에 대한 자기장의 효과를 설명하는 실험의 상세한 분석은 그럴듯 생물 물리학 적 상호 작용 메커니즘 결핍을 특징으로 충돌 보고서, 다수를 나타낸다. 다른 사람들이 궁극적으로, 3 설득력이있다, 검증 가능한 가설이 부족하면서 많은 실험은, 단순히 비현실적이다. 지난 몇 년 동안 식물에 자기장의 영향에 진보와 연구의 상태는 2,4-11을 검토하고있다. 최근, 낮고 높은 자기장의 효과는 충분히 발전 플랜트 2 GMF 반전 이벤트 참여에 특히 초점을 맞춘 하나를 논의하고있다.
가장 직접적인 수단은 GMF 역전 식물의 진화는 GMF를 합성하는 것입니다 영향을 미치는 가설을 입증하기정상 및 반전 자계 상태에 식물의 응답을 테스트하여 실험실에서 반전. 가설을 시험하기 위해, 우리는 따라서 정확하게 정상 GMF 조건 역방향 수 각형 축 헬름홀츠 코일 쌍 자계 보정 시스템 (축 코일)를 구축했다.
우리는 모델 식물로 애기 장대를 사용하여 우리는 몇 가지 중요한 유전자의 유전자 발현에 반대 GMF의 효과 테스트 : CRUCIFERIN 3 (CRU3), 티로신 인산화이고 그것의 인산화 상태가 응답 변조 12S 종자 저장 단백질을 암호화 애기 장대 씨앗 12,13에서 ABA에; 토양 구리 수집 및 꽃가루 개발 (14)의 주된 기능을 가진 중금속 전송 / 해독 상과 단백질을 코딩하는 구리 운송 Protein1 (COTP1); 및 산화 – 환원 응답 전사 Factor1 (RRTF1)즉, ERF (에틸렌 응답 인자) 아과의 B-3 유전자 발현 경로의 상승 공동 활성화를 촉진하고 비 생물 교차 내성을 부여하고 생물 15 강조 한 AP2 도메인을 포함 ERF / AP2 전사 인자 패밀리의 구성원을 암호화한다.
더욱이 우리는 또한 산화 스트레스 반응에 관여하는 다섯 유전자 분석 : 효소 적으로 빠르게 슈퍼 옥사이드 음이온 변환 세포질 효소를 코딩 철 과산화물 Dismutase1 (FSD1)를, (O 2 -) 및 물 (H 2 O) 과산화수소 (H 물과 산소 (17, 18)로 H의 붕괴 2 O 2 촉매 Catalase3 (즉, 인코딩 것을 CAT3), 효소, 2 O 2)와 산소 분자 (O 2) 16 Thylakoidal 아스코르브 퍼 옥시 다제 (TAPX), 인코딩 H 2 O를 청소합니다 엽록체 틸라코이드 퍼 옥시 다제2 (19), H 2 O 2를 없애고 NO 유래 분자 (20)에 의해 매개 번역 후 변형의 잠재적 인 목표 중 하나를 나타냅니다 세포질 퍼 옥시 다제를 암호화 아스코르브 Peroxidase1 (APX1); 및 O 2를 생성하는 효소 인코딩 NADPH- 호흡기 버스트 산화 효소 단백질 D (RbohD) – 및 애기 장대 (21)의 성장, 개발 및 스트레스 반응을 조절하는 중요한 역할을합니다.
우리의 필드 – 반전 방법론 GMF의 반전 A.의 형태학 및 유전자 발현에서 유의 한 변화를 유도 할 수 있다는 첫번째 증거를 제공한다 장대 뿌리 촬영. 이 프로토콜은 RO의 논의 식물 형태학 및 유전자 발현에 GMF 반전의 효과를 평가하고, 식물의 동작의 다른 측면에 GMF 반전의 잠재적 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 의해 안내 혁신적인 방법을 제공한다식물의 진화에 GMF 반전의 제작.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 최근 놀라운 상관 관계가 GMF 반전과 가족 피자 식물 계통의 대부분의 전환 2 발생한 시간 사이에 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, GMF 반전 자체가 식물 유전자 발현과 형태에 상당한 변화를 유도 할 수있는 자극 가설하고 다양한 GMF 강도의 효과에 대한 연구의 과다, 가정에도 불구하고 입증 된 적이있다. 여기서 우리는, 처음 우리 실험실에서 GMF를 반대로 축 각형 헬름홀츠 코일을 사용하고, 주변 자계의 반전 표현형 변화 및 식물에서 유전자 발현의 조절을 일으킬 수있는 방법을 보여준다.
식물 생장 실험 (2 × 2 × 2m 3)에 대한 충분한 양 위에 GMF 반전 (또는 수정)를 얻기 위해, 우리는 팔각형 헬름홀츠 코일 시스템을 구축했다. 이 시스템은 (일반적으로 헬름홀츠 코일 링 모양의 작은된다)를 상업적으로 사용할 수 없습니다건설에 대한 비용은 상당한했다. 중요한 것은,이 시스템은 수정 된 자기장에 뛰어난 시간 안정성 및 균질성 견고한 필드의 변경을 제공한다.
시스템이 정상 상태로 천분의 GMF의 값을 감소 시키거나 자기장의 입체적 임의 역방향 설계 및 구축된다. 그러나, 코일의 설계는 높은 자기장 세기를 생성 할 수 없습니다. 따라서, 본 형태의이 장비는 식물이나 다른 생물에 높은 자기장 강도의 효과를 평가하기위한 실험에 적합하지 않습니다.
실험실에서는, 이러한 방법에 기재된 것과 유사한 GMF의 변화는 자기장을 벗어나 금속 자체 내에서 농축 높은 투자율과 강자성 금속 플레이트에 의해 실험적 영역을 둘러싸 의해 차폐 포함한 다양한 방법에 의해 얻어진다. 목헬름홀츠 코일을 이용하는 전자의 이점은 시스템 따라서뿐만 아니라 시험관 내 연구 (배양 접시의 사용과 같은) 이상 또한 만드는 식물보다 자연 조건 (빛, 공기 순환 등)에 노출 될 수 있다는 것이다 생체 내 식물의 성장 및 개발 실험. 우리 시스템 사이즈 따라서 여러 페트리 접시 또는 일부 작은 호스트 있도록 (도 1a 참조)를 25 × 25 × 25 ㎤의 구면 볼륨에 걸쳐 천연 GMF의 <1 / 1,000까지 억제 할 수있는 공간을 만들어 식물의 성장을위한 냄비.
여기에 제시된 방법은 식물 생물학 연구에 적용되었습니다; 그러나 시스템은 바이러스학 및 미생물학 실험 포함한 광범위한 허용뿐만 아니라, 선충 (예, 예쁜 꼬마 선충), 및 절지 동물 (마우스 및 래트를 포함)에 작은 동물 연구. 따라서, 가설의 시험 GMF의 역전 할 수있다형태와 전사의 변화는 아마도 궁극적으로도 인간의 세포에, 다른 많은 생명체로 확장 될 수있다 유도.
GMF는 끊임없이 변화 및 변동됩니다. 따라서, 우리의 실험에 하나의 주요 과제는 원하는 새로운 GMF 값들을 획득하기 위해 GMF의 일정한 보상을 제공하는 것이다. 이것은 단지 자력계 값 및 전압 보상의 판독을 통해 자기장 값의 연속 제어에 의해 달성 될 수있다. 따라서, 시스템의 GMF 서서히 변하는 부분을 보상 할 수 있지만, 더 높은 주파수의 변동에 대해 아무것도하지 않는다.
결론적 GMF 벡터를 반대로 축 코일의 사용은 GMF 벡터의 반전이 식물 형태 변화 및 차등 유전자 발현을 유도 할 수 있다는 것을 입증하기에 쓸모 있었다. 제시된 방법으로 얻어진 결과들은 가설 GMF 재지지하는 강력한 증거를 제공한다versals은 지질 학적 시간 척도 2 위에 식물 진화의 원동력 중 하나가되었을 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
Materials
| three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |
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