Medindo Taxas de Herbicida Metabolismo em Dicot Weeds com um ensaio extirpado Folha

Resistência a herbicidas em ervas daninhas apresenta uma séria ameaça para a produção mundial de alimentos e fibras ^1,2. Atualmente, milhares de populações resistentes e biótipos de mais de cem espécies de plantas daninhas em todo o mundo têm sido documentadas e estudadas ^3. Um importante mecanismo que confere resistência a herbicida em plantas, é a alteração de herbicidas genes e proteínas do local-alvo, incluindo as mutações genéticas que afectam a cinética de ligação proteína-herbicida ou amplificação do gene-alvo local ^2. Desintoxicação metabólica via actividades elevados de mono-oxigenase citocromo P450 (P450) ou glutationa S -transferase (GST) enzimas é outro mecanismo que confere resistência a herbicidas em ervas daninhas, que é distinto de várias formas de mecanismos baseados em local de destino ^2. Resistência à base metabólica tem ramificações significativas para se os custos de fitness planta (aka sanções aptidão) pode resultar dos mechanis de resistência ao herbicidam, bem como em relação ao potencial para um único mecanismo de desintoxicação para conferir resistência cruzada ou de vários herbicidas em populações de plantas daninhas ^1,2,4. Geralmente, o metabolismo do herbicida em plantas pode ser dividida em três fases distintas ^5. Fase I envolve a conversão herbicida ou de activação tal como hidroxilação P450-mediada de anéis aromáticos ou grupos alquilo, ou por N – ou reacções de desalquilação O-, levando ao aumento da polaridade e herbicida parcial desintoxicação ^5,6. Recentemente introduzido grupos funcionais na Fase I podem proporcionar sítios de ligação para conjugação de glutationa reduzida por GSTs ou para glicose pelo glicosiltransferases UDP-dependentes na Fase II ^5,7. Por exemplo, o principal metabolito inicial de primi sul furão-metilo no milho é hidroxi-primi sul furão-metilo ^8, que pode ser posteriormente metabolizado para hidroxi-primisulfurão-glucósido (Fase II) e, em seguida, transportados para o vacúolo para armazenamento a longo prazo ou mais metabólica prócessamento ^5,6 (Fase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) é uma de difícil controle, dicot espécies de plantas daninhas anuais que dificulta a produção de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e algodão (Gossypium hirsutum) nos Estados Unidos. O alto grau de diversidade genética de waterhemp é facilitada pela sua biologia dióico e de longa distância vento polinização, e uma única planta waterhemp fêmea pode produzir até um milhão de sementes ^9. Estas sementes são pequenas e facilmente se espalhar, o que naturalmente dotar waterhemp com um mecanismo de dispersão eficaz. Waterhemp exibe germinação contínua durante todo o período de crescimento ^9, e suas sementes são capazes de germinar após vários anos de dormência. Waterhemp é uma planta _C 4 que possui uma taxa de crescimento mais elevada do que a maioria das ervas daninhas de folha larga em sistemas de culturas arvenses ^10. Além disso, numerosas populações waterhemp são resistentes a múltiplos famílias de herbicidas ^3.

Uma população de waterhemp (designado MCR) de Illinois é resistente à 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) herbicidas -inhibiting ^11, tais como a mesotriona, bem como a atrazina e acetolactato sintase (ALS) -inhibiting herbicidas, incluindo primi sul furão-metilo , devido à não-alvo do local mecanismos baseados ^12,13. Uma população diferente de waterhemp designado ACR ^14, que é-primi sul furão-metilo resistentes (devido a uma mutação no gene de ALS) e atrazina-resistentes, mas sensível a mesotriona, e uma população waterhemp designado WCS ¹⁴ que é sensível à primi sul furão-metilo, mesotriona, atrazina e foram usadas em comparação com MCR na nossa pesquisa anterior ¹² e experiências actuais (resumidas na Tabela 1). Estudos iniciais não detectaram alterações nos níveis de sequências genéticas HPPD ou expressão, ou reduzida absorção mesotriona, no MCRpopulação quando comparados com populações sensíveis à mesotriona ^12. No entanto, estudos de metabolismo com plantas inteiras mostraram níveis significativamente mais baixos de pai mesotriona herbicida em comparação com o ACR MCR e WCS, o que se correlacionou com respostas fenotípicas anteriores para mesotrione ^11,12.

* Mecanismos de resistência não-alvo do local, com excepção metabolismo reforçada, também podem conferir resistência mesotriona na população MCR ^12.

Tabela 1: Descrição das populações waterhemp de Illinois utilizados neste estudo.

Além de determinar as taxas de metabolismo herbicida em plântulas waterhemp intactas, uma abordagem experimental diferente foi desenvolvido e utilizado na nossa investigação anterior para investigar o metabolismo usando um ensaio excisado waterhemp folha ^12, bem como vários inibidores de P450 (por exemplo, tetcyclacis e malatião). Este método foi adaptado especificamente para waterhemp de um PREVIinvestigação ous do metabolismo primisulfurão-metil em milho extirpado deixa ^15, uma vez que o ensaio de folha excisada ainda não haviam sido notificados para a realização de pesquisas metabolismo herbicida numa planta dicotiledônea. O inseticida malathion organophophosate tem sido frequentemente utilizado para in vivo e em pesquisa herbicida metabolismo vitro para indicar envolvimento P450 ^16. Por exemplo, a tolerância eo metabolismo rápido de mesotriona no milho são devido a hidroxilação do anel P450 catalisada, o que foi verificado quando malathion aumento da sensibilidade do milho para mesotriona ^17. Da mesma forma, malatião inibiu o metabolismo do inibidor de primi sul furão-metilo ALS de milho em folhas excisadas ^15. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada é que os dados gerados são independentes de padrões de translocação da planta inteira de, um factor importante a considerar quando se avalia o metabolismo de sistémicas, herbicidas pós-emergentes em plantas. Por conseguinte, este método permite que quantitativa emetabólica análises qualitativas para se concentrar em uma única folha tratada ^12.

Uma estratégia de clonagem vegetativo, em combinação com o protocolo de folha excisada, foi previamente utilizado em waterhemp para conduzir estudos de metabolismo ^12. Devido à natureza de cruzamento de waterhemp (plantas masculinas e femininas separadas), e elevado grau de diversidade genética dentro das espécies Amaranthus dióicas ^9, este protocolo assegurado que waterhemp mudas geneticamente idênticas foram analisadas dentro dos experimentos longo do tempo. Este artigo demonstra a utilidade do método para a medição de folha excisada taxas de metabolismo herbicida em plantas daninhas dicotiledóneas um (waterhemp). A quantidade de herbicida-mãe remanescente foi determinada em cada ponto de tempo (Figura 1) por análise não linear de regressão dos mínimos quadrados, e foi adequado com uma curva de primeira ordem simples, a fim de estimar o tempo para 50% de herbicida absorvida para degradar ( DT _50). Representantecromatogramas da cromatograf ia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) são exibidos para ALS-resistentes e sensíveis ao waterhemp populações, que indicam o desaparecimento de herbicida-mãe e formação concomitante de metabolito polar (s) durante um estudo de tempo-curso (figura 2). O foco do nosso artigo é descrever e demonstrar a utilidade do ensaio da folha excisada em combinação com um método de clonagem vegetativa para determinar as taxas precisas e reprodutíveis do metabolismo de herbicidas em plantas dicotiledôneas, utilizando anel marcado ^(URL-14 C) herbicidas de maneira uniforme em três populações waterhemp que diferem nas suas respostas a planta inteira de HPPD- e inibidores da ALS herbicidas (Tabela 1).