Mesurer les taux de métabolisme dans l'herbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille

La résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes présente une grave menace pour la production mondiale de nourriture et de fibres ^1,2. Actuellement, des milliers de populations résistantes et de biotypes de plus d'une centaine espèces de mauvaises herbes dans le monde entier ont été documentés et étudiés ^3. Un mécanisme majeur qui confère une résistance aux herbicides dans des plantes est l'altération herbicide de gènes et de protéines à un site cible, y compris des mutations génétiques qui affectent la cinétique ou l'amplification du gène de site de liaison cible herbicide ^2-protéine. Désintoxication métabolique grâce à des activités élevées de la cytochrome P450 monooxygénase (P450) ou le glutathion S -transferase (TPS) enzymes est un autre mécanisme qui confère une résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes, qui est distinct de plusieurs façons de mécanismes fondés sur-site cible ^2. La résistance en fonction métabolique a des ramifications importantes pour savoir si les coûts de remise en forme de la plante (aka pénalités de remise en forme) peuvent entraîner des mechanis résistance aux herbicidesm, ainsi que sur le potentiel d'un mécanisme unique de désintoxication pour conférer une résistance croisée ou plusieurs herbicides dans les populations de mauvaises herbes ^1,2,4. En général, le métabolisme de l'herbicide dans les plantes peut être divisé en trois phases distinctes ^5. Phase I implique la conversion d'herbicide ou d'activation tel que P450 hydroxylation de noyaux aromatiques ou des groupes alkyle, ou par N – réactions de désalkylation ou o-, ce qui augmente la polarité et de l'herbicide ^5,6 partiel désintoxication. Nouvellement introduit des groupes fonctionnels dans la Phase I peuvent fournir des sites de liaison pour la conjugaison au glutathion réduit par GST ou en glucose par glycosyltransférases dépendants UDP dans la phase II ^{de 5,7.} Par exemple, le principal métabolite initial de primisulfuron-méthyle dans le maïs est un groupe hydroxy-primisulfuron-méthyl ^8, qui peut être métabolisé en hydroxy-primisulfuron-glucoside (Phase II) et ensuite transporté vers la vacuole pour le stockage à long terme ou encore métabolique pro^5,6 transformation (phase III).

Tuberculée (Amaranthus tuberculatus) est une tâche difficile à contrôler, les espèces de dicotylédones annuelles de mauvaises herbes qui entrave la production de maïs (Zea mays), le soja (Glycine max) et le coton (Gossypium hirsutum) aux États-Unis. Le degré élevé de diversité génétique des tuberculée est facilitée par sa biologie dioïque et longue distance pollinisation par le vent, et un plant femelle unique tuberculée peut produire jusqu'à un million de graines ^9. Ces graines sont petites et se propager facilement, qui lui confèrent naturellement tuberculée avec un mécanisme de dispersion efficace. Tuberculée affiche la germination continue tout au long de la saison de croissance ^9, et ses graines sont capables de germer après plusieurs années d'inactivité. Tuberculée est une plante C ₄ qui possède un taux de croissance plus élevé que la plupart des mauvaises herbes à feuilles larges dans les systèmes de culture arables ^10. En outre, de nombreuses populations de tuberculée sont résistants à la fam multiplesilles d'herbicides ^3.

Une population de tuberculée (désigné MCR) de l'Illinois est résistant à la 4-hydroxy-phénylpyruvate dioxygénase (HPPD) herbicides inhibant ^11, tels que la mésotrione, ainsi que pour l'atrazine et acétolactate synthase (ALS) herbicides inhibant, y compris primisulfuron-méthyl , en raison de la non-cible site mécanismes fondés ^12,13. Une population différente de tuberculée désigné ACR ^14, qui est résistant primisulfuron-méthyl-(en raison d'une mutation dans le gène ALS) et de l'atrazine résistantes mais sensibles à la mésotrione, et une population de tuberculée désigné WCS ¹⁴ qui est sensible au primisulfuron-méthyle, mésotrione, et l'atrazine ont été utilisés en comparaison avec MCR dans notre recherche avant ^{12 et} les expériences en cours (résumés dans le tableau 1). Des études initiales ne pas détecter des altérations dans les niveaux de la séquence de gène de l'HPPD ou d'expression, ou l'absorption de la mésotrione réduit, dans le MCRpopulation par rapport aux populations de mésotrione sensible ^12. Cependant, les études de métabolisme avec des plantes entières ont démontré des niveaux significativement plus faibles de l'herbicide parent de mésotrione dans MCR par rapport à l'ACR et le WCS, qui en corrélation avec les réponses phénotypiques précédentes pour mésotrione ^11,12.

* Mécanismes de résistance non-target-site, autres que métabolisme accru, peuvent également conférer à la population MCR ¹² résistance à la mésotrione.

Tableau 1: description des populations de tuberculée de Illinois utilisés dans cette étude.

En plus de déterminer les taux de métabolisme de l'herbicide dans les semis de tuberculée intactes, une approche expérimentale différente a été développée et utilisée dans notre étude précédente pour étudier le métabolisme en utilisant un tuberculée test sur ​​feuilles excisées ¹² ainsi que divers inhibiteurs du cytochrome P450 (par exemple, tetcyclacis et malathion). Cette méthode a été adaptée spécifiquement pour tuberculée d'un PREVIous enquête du métabolisme du primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse ^15, depuis le test de la feuille excisée n'a pas encore été signalé pour mener des recherches sur le métabolisme de l'herbicide dans une usine de dicotylédones. L'insecticide malathion organophophosate a été fréquemment utilisé pour in vivo et dans la recherche herbicides métabolisme in vitro pour indiquer la participation de ¹⁶ P450. Par exemple, la tolérance et le métabolisme rapide de la mésotrione dans le maïs sont dues à P450 catalysée par hydroxylation de l'anneau, qui a été vérifiée lorsque le malathion sensibilité accrue du maïs pour la mésotrione ^17. De même, le malathion a inhibé le métabolisme de l'Inhibiteur de l'ALS primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse ^15. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée est que les données générées sont indépendantes de motifs de translocation de plantes entières, un facteur important à considérer lors de l'évaluation du métabolisme systémique, herbicides de postlevée dans les plantes. En conséquence, cette méthode permet quantitative etanalyse métabolique qualitative de se concentrer sur une seule feuille traitée ^12.

Une stratégie de clonage végétative, en combinaison avec le protocole de la feuille excisée, a déjà été utilisé dans tuberculée de mener des études sur le métabolisme ^12. En raison de la nature de la pollinisation croisée tuberculée (séparés pour les hommes et les plantes femelles), et un grand degré de diversité génétique au sein des espèces d'Amaranthus dioïque ^9, ce protocole a assuré que les semis de tuberculée génétiquement identiques ont été analysés dans les expériences de temps bien sûr. Cet article démontre l'utilité de la méthode de la feuille excisée pour mesurer les taux de métabolisme de l'herbicide dans une mauvaise herbe dicotylédone (de tuberculée). La quantité d'herbicide parent restant a été déterminée à chaque point (figure 1) de temps en moins l'analyse des carrés de régression non linéaire, et a été en forme avec une courbe simple de premier ordre afin d'estimer le temps pour 50% d'herbicide absorbé à se dégrader ( DT _50). Représentantchromatogrammes de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) sont affichés pour la SLA-résistants et les populations de tuberculée -sensibles, qui indiquent la disparition de l'herbicide mère et la formation concomitante de métabolite (s) polaire à une étude des temps bien sûr (Figure 2). L'objectif de notre article est de décrire et de démontrer l'utilité de l'analyse de la feuille excisée en combinaison avec une méthode de clonage végétal pour déterminer les taux précis et reproductibles du métabolisme des herbicides dans les plantes dicotylédones, en utilisant uniformément anneau marqué (URL- ¹⁴ C) herbicides trois populations de tuberculée qui diffèrent dans leurs réponses de plantes entières à HPPD- et herbicides inhibant l'ALS (tableau 1).