Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
Ultralyd refererer til en oscillerende lydtrykket bølge med en frekvens som er større enn den øvre grense av menneskelige hørselskapasitet (~ 20 kHz) 1. Lavfrekvente ultralyd i 20-60 kHz ble benyttet i laboratoriet som et middel til å generere emulsjoner, forbereder celleprøver for nukleinsyre-ekstraksjon, for vev avbrudd, og for en rekke andre tester. Nytten av lavfrekvente ultralyd har også blitt utvidet til industriell setting for sveising, rengjøring ulike materialer og materialbehandling. Kommersielt tilgjengelige ultralyd generatorer kommer i frekvenser som spenner 18-60 kHz, og fullskala wattstyrker fra 100-1,200 W.
Selv om ultralyd har lenge vært brukt i den kliniske setting for bildediagnostikk, har det blitt brukt som et terapeutisk modalitet bare nylig. Ultralyd ≥1 MHz er i stand til å trygt forstyrrende nyrestein (nyrestein) og gallesten (steiner i the galleblæren eller i leveren) hos pasienter for å redusere symptomene 2,3. Denne tilnærmingen kalles ekstra shockwave lithotripsy (ESWL) er nå mye brukt i klinikken (mer enn en million pasienter behandles årlig med ESWL i USA alene 4), og tilbyr en modalitet der til ikke-invasiv bryte opp sten med minimal sivile skader ved bruk av eksternt påført, fokuserte høy intensitet akustiske pulser 2-4.
På grunn av de unike direkte skjærkrefter, samt kavitasjonsbobler som genereres av høy intensitet ultralyd, har disse metoder blitt undersøkt i cancerterapi for behandling av kastrering resistent prostatakarsinom og pankreatisk adenokarsinom i en metode kjent som høy intensitet fokusert ultralyd (HIFU ) 5-8. På en måte som er svært lik ESWL bruker hifu flere ultralydstråler og fokuserer dem på et valgt samlingsområde for å generere temperaturer på 60 ° C eller highenne gjennom bruk av akustisk energi, indusere koagulative nekrose i målvevet 5. Selv om andre modaliteter av termisk ablasjon dag eksisterer (radiofrekvensablasjon og mikrobølgeovn ablasjon), HIFU tilbyr en klar fordel over disse metodene i at det er den eneste ikke-invasive hyperthermic modalitet 5. HIFU har oppnådd blandede resultater i klinikken og er foreløpig kun tilgjengelig i kliniske studier 8-11. Likevel har den begrensede suksessen den har oppnådd, og det meget lovende in vivo data innhentet fra prekliniske pattedyr modeller demonstrert potensialet av ultralyd i kreftbehandling.
I et forsøk på å forbedre HIFU, har forskere forsøkt å kombinere ultralyd med passende antineoplastiske midler for å generere en form for sonochemotherapy. Sonodynamic terapi (SDT) er en lovende ny behandlingsform som har vist imponerende antineoplastisk aktivitet både in vitro og <em> In vivo studier 1. Det er blitt vist at ultralyd preferensielt skader ondartede celler basert på størrelsen forskjellen mellom slike celler, og de av normal histologi 1,5. SDT omfatter spesialiserte midler kjent som sonosensitizers å øke omfanget av preferanse skade utøves av ultralyd mot neoplastiske celler. Selv om terapeutiske anvendelser av SDT har tidligere blitt undersøkt, ultralydsystemer brukt anvender typisk høyere frekvens ultralyd (≥1 MHz), og effekten av lave kHz ultralyd har ennå ikke fullt utforsket. Lavere frekvenser av ultralyd er ofte mer dyktig til å produsere treghets kavitasjon, et fenomen som resulterer i ødeleggelsen av celler som på grunn av den raske sammenleggingen av mikrobobler, indusere fysikalsk skade 12-14. Denne forskjellen i generering av treghet kavitasjon mellom MHz og lav kHz ultralyd har blitt tilskrevet det faktum at lavere wave frekvenser aktivere mikrobobleer mer tid til å vokse med utbedret diffusjon i utvidelsen halvperiode, dermed produsere mer voldelige kollapser under følgende komprimering halvperiode 12.
Vi har tidligere vist at U937 humane monocyttiske leukemiceller er følsomme for lavfrekvente ultralyd (23,5 kHz), og at denne følsomhet kan økes betydelig ved anvendelse av antineoplastiske midler som forstyrre cytoskjelettet 15. Videre har vi vist at cellene er fortrinnsvis skadet basert på størrelse, med større celler som utviser høyere ultralyd følsomhet. I tillegg normale humane hematopoetiske stamceller (hHSCs) og leukocytter ved sammenlignbare cellestørrelser er mye mer motstandsdyktig mot ultralydbehandling enn sine motstykker neoplastiske 15, forsøksvis som tyder på at lavfrekvent ultralyd kan brukes for fortrinnsvis å ødelegge maligne celler i nærvær av normalt vev.
For ytterligere å undersøke den unike propskapene til lavfrekvent ultralyd for potensiell terapeutisk bruk, har vi utviklet rengjøring og stabiliserings prosedyrer for å øke effektiviteten og påliteligheten til en av våre nåværende ultralydsystemer, Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, utstyrt med en 20 mm horn montert inn i en 7,62 cm cup. I tillegg har vi vært i stand til å bestemme nøyaktig prøve kavitasjon energier, samt konsistente bølgeformer og amplitude innenfor 40 kHz ved hjelp av en kavitasjon meter og oscilloskop med hydrofon. Ved raffinering og systematisere våre protokoller, har vi vært i stand til å etablere konsistens i våre eksperimentelle sonications, tillater oss å kvantitativt sammenligne de soniske sensitiviteter av neoplastiske og normale celler i ulike histogenetic linjene. Vår protokoll for 40 kHz system er vist i detalj for omfattende for interesserte laboratorier for å være i stand til å utføre tilsvarende forsøk, og for å evaluere våre funn av antineoplastiske effekter fremkalt avlavfrekvent ultralyd. I tillegg har vi undersøke de doseavhengige virkninger av metyl-β-cyklodekstrin (MeβCD; figur 1), et kolesterolreduserende middel, for å øke følsomheten av ultralyd U937 og THP1 humane monocyttiske leukemiceller.
For å oppnå optimale resultater, bør man være spesielt forsiktig å nøye plassere prøven og rengjør converter-horn union. Plassering av prøven i hornet er viktig for å oppnå konsistent celle ødeleggelse, som å endre avstanden fra hornet vil forandre den akustiske brennpunkter, og dermed endrer energien prøven blir utsatt for. Den akustiske energi innenfor koppen horn kan kartlegges ved hjelp av kavitasjon apparatet til å finne posisjonen av maksimal kavitasjon. I tillegg er det kavitasjon meter, sammen med oscilloskopet er avgjørende for bestemmelse av lydintensitet cellene blir utsatt for, såvel som homogeniteten av bølgeformen. Derfor bør disse instrumentene brukes til å oppdage problemer med systemet, og bidra til å bestemme hva feilsøking kan være nødvendig å korrigere ustabilitet i systemet.
Som tidligere nevnt, kan den lavfrekvente systemet virke til ytterligere avgasse vann gjennom hele forsøket hvis ikke kjøre forflere minutter før prøve lydbehandling. Dette første løp må utføres for å gi en forholdsvis avgasset sonikering medium og således ensartede resultater i løpet av eksperimentene. I tillegg bør ikke cellene sonikert ved eller i nærheten av den maksimale amplitude ved vurdering av effekten av sonosensitizers, som det virkelige omfanget av sensibilisering ville være vanskelig å vurdere. Ved hjelp av 33% amplitude på 40 kHz system er en ideell setting, som den produserer bemerkelsesverdig skade, men gir sonosensitizers god plass til å vise sin effekt, som demonstrert med MeβCD mot U937 og THP1 celler (figur 7). Disse data bekrefter også at MeβCD sensitizes flere leukemi linjer til lavfrekvent ultralyd på en doseavhengig måte.
Det har vært et antall forsøk utført med høyere frekvens i området på 0,75 MHz til 8 MHz som viser tegn på intramembrane kavitasjonsbobler som blir generert gjennom ultralydbehandling 17-19. Men questions fortsatt i forhold til den eksakte mekanismen av ultralyd-indusert cellelyse 18. Vi har vist en kobling mellom fluidisering av cytoskjelettet og sonisk økt følsomhet ved hjelp av lavfrekvente ultralyd 15, et fenomen som demonstrert ved andre laboratorier 20, 21. I tillegg er det funnet at filaforstyrrende midler slik som cytochalasin B potensere ultralydsensitivitet i multiple leukemi linjer, men ikke hHSCs eller leukocytter 22, tyder på at inhibering av aktin Polymeriseringen kan være en sonosensitizing mekanisme av spesiell interesse. Vi har også observert at vincristin, et mikrotubulus-forstyrre middel som inhiberer tubulin polymerisering 23, 24, vesentlig øker følsomheten av ultralyd forskjellige leukemityper in vitro, inkludert akutt myelogen leukemi, kronisk myelogen leukemi, og akutt lymfoid leukemi. I motsetning cytoskeletal-rettede midler som stabiliserer cytoskeletal komponenter (paclitaxel end jasplakinolide) ser ut til å gjøre cellene motstandsdyktig mot lydbehandling, reflekteres av lavere priser på cellelysis 22. Samlet utgjør disse data støtter hypotesen om at fluidisering av cytoskeletal komponentene av neoplastiske celler er faktisk en viktig faktor for å øke effekten av SDT 25. Den foreliggende undersøkelse viser også at kolesterol uttømming kan være en annen metode for å ytterligere forsterke den ultrasoniske følsomheten av neoplastiske celler, som MeβCD-behandlede U937 celler er markert sensibilisert for 40 kHz ultralyd.
Mens våre ultralyd protokoller har vist markert antineoplastisk aktivitet in vitro, er den nåværende metodikk begrenset til å jobbe i kultur og små virveldyr modeller som er i stand til å passe i hetteglassene brukes for lydbehandling. Vi har vist at sebrafisk kan trygt sonikert ved bruk av pulset lavfrekvent ultralyd (20 kHz), og at deres toleranse overfor kjemoterapeutiske midler er kvantitativt sammenligndoser tolereres av murine modeller 26, noe som tyder på at tumorbærende sebrafisk kan anvendes i innledende undersøkelser for å bedømme in vivo antineoplastisk aktivitet av disse protokollene. Likevel administrering kjemoterapeutiske midler før sonikering av pattedyrmodeller har blitt rapportert i MHz-området 1, og slike protokoller kan sannsynligvis bli utvidet til å innlemme lavfrekvent ultralyd, så vel som kolesterolreduserende og cytoskeletal styrt midler.
Potensielle kliniske anvendelser av denne form for SDT kan involvere utenomlegemlig blod sonikering i hvilken antineoplastiske midler administreres intravenøst (iv) før blodet blir fjernet for 25 ultralydbehandling. Denne metoden fjerner potensielle støyskjermer som utgjøres av menneskets anatomi, og kan være en effektiv måte å ødelegge leukemi blasts, samt metastaser fra solide tumorer. Det er også mulig at kolesterolreduserende og cytoskeletal styrt midler kunnebrukes i HIFU protokoller som allerede er undersøkt i klinikken i et forsøk på å forbedre effektiviteten ved denne behandlingsform.
Metodene som er beskrevet i denne studien er i stand til å vurdere verdien av potensielle sonosensitizers, og videre system raffinement kan forsterke dette verktøyet. Men det er mange variabler som skal vurderes ved bruk av slike ultralyd planlegger, inkludert strømforsyningen kvalitet, akustiske brennpunkter, og individuell variasjon blant omformere. Derfor vil fremtidig forskning fokusere på å visualisere de soniske bølger og forstå deres innflytelse på resultatene. SDT har vist seg å forbedre cellelysis in vitro, og kan vise seg å være klinisk levedyktig dersom mer in vivo data i pattedyr modeller er anskaffet. Eksperimenter som undersøker andre potensielt utnyttbare kjennetegn ved ondartede celler, samt ulike kombinerte modaliteter som involverer flere agenter og ultralyd fortsette i vårt laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |