Экс Vivo культуры глотки Арки для изучения Сердце и мышцы предшественников и свою нишу
Summary
Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.
Abstract
Глотки мезодерма развивающихся эмбрионов способствует широких областей головы и сердца мускулатуры. Мы разработали новый метод изучения голова и сердце предшественников развития клеток с глотки арок (также известный как жаберных дуг) Экс Vivo. Используя этот метод, мы недавно рассказал, что второй глоточной дуги содержит самообновлению сердце предшественники и служит микросреды для расширения предшественников во время развития мыши сердца. Клетки-предшественники остаются недифференцированными и экспансивной внутри арки, но быстро становятся функциональные кардиомиоциты, поскольку они мигрируют из арки. Мы также сообщали, что сначала глотки арки содержит мышечные клетки-предшественники, порождающих мышечные трубки после выхода из арки. Здесь мы демонстрируем порядок вскрытия и экс естественных условиях культуры первой и второй глотки арок из развивающихся эмбрионов мыши. Метод позволяет изучать голова и сердце предшественников / Dev мышцelopment, в том числе кардиомиоцитов и myotube образования в деталях экс естественных условиях.
Introduction
Глоточные мезодермы клетки дают начало части сердца и глотки мышц. Во время эмбрионального развития, мультипотентные сердечные клетки-предшественники из второго поля сердца мигрировать из глотки мезодермы и заполнить сердца тракт оттока и правый желудочек, и их аномальное развитие тесно связано с заболеванием-врожденных сердце ведущей причиной врожденных дефектов и рождении defect- смертей у людей. 1-3 Последние исследования показали, что мезодерма глотки способствует возглавить мышцы, в дополнение к сердцу, что делает мезодерма важной частью сердечно-лицевых развития 4. Таким образом, процессы развития, включая индукционные, пролиферации и дифференцировки головных и сердечных клеток-предшественников в глотки мезодермы находятся под активным следствием 5-7.
До недавнего времени оставалось неизвестным ли клетки сердечной предшественники подвергаются расширения withoут дифференциация, частично из-за отсутствия информации об их клеточной среде. Наше недавнее исследование показывает, что глоточные арки служат микросреды для возобновления сердечных и мышечных клеток-предшественников и может быть культурным экс естественных условиях в течение нескольких недель 8. Этот метод эксплантов предлагает новый и уникальную возможность для изучения развития сердечно-черепно-лицевой предшественников бывших естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом видео, мы демонстрируем, как изолировать и культура первой и второй глотки арки 9.5 дней эмбрионов мыши. Глоточные арки переходный Географическая выпуклости, которые появляются на craniolateral стороны развивающихся эмбрионов 9, которые содержат несколько мощных сердечной клетки…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).
Materials
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10cm petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 | |
References
- Kelly, R. G. The second heart field. Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
