Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie
Summary
Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.
Abstract
De keelholte mesoderm ontwikkelen van embryo's draagt bij aan een brede regio van hoofd en hart spiermassa. We hebben een nieuwe werkwijze voor hoofd en hart progenitor cel ontwikkeling met pharynxbogen (ook bekend als kieuwbogen) ex vivo kunnen onderzoeken. Met behulp van deze methode, hebben we onlangs beschreven dat de tweede faryngeale boog bevat zelfvernieuwende hart voorlopers en dient als een micro-omgeving voor uitbreiding van de voorouders tijdens muis ontwikkeling van het hart. De voorlopercellen blijven ongedifferentieerde en uitgestrekte in de boog, maar al snel uitgegroeid tot functionele cardiomyocyten als ze migreren van de boog. We hebben ook gemeld dat de eerste keelholte boog bevat spier voorouders die aanleiding geven tot myotubes na het verlaten van de boog. Hier tonen we de procedure voor de dissectie en ex vivo cultuur van de eerste en tweede pharynxbogen uit ontwikkelingslanden muis embryo's. De methode maakt het mogelijk om hoofd en hart voorlopercellen / spier dev studerenelopment, waaronder cardiomyocyt en myotube vorming in detail ex vivo.
Introduction
Faryngeale mesodermcellen leiden tot delen van het hart en de faryngeale spieren. Tijdens de embryonale ontwikkeling, multipotent cardiale stamcellen uit het tweede hart veld migreren van de keelholte mesoderm en bevolken de cardiale uitstroombaan en rechter ventrikel, en hun abnormale ontwikkeling is nauw verbonden met een aangeboren hartaandoening-de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijkingen en geboorte defect- gerelateerde sterfgevallen bij de mens 1-3. Recente studies hebben aangetoond dat pharynx mesoderm bijdraagt aan hoofdspieren naast het hart, waardoor het mesoderm een kritisch onderdeel van de cardio-craniofaciale ontwikkeling 4. Zo is de ontwikkelingsprocessen inclusief inductie, proliferatie en differentiatie van hoofd en hart voorlopers in de keelholte mesoderm zijn actief onderzocht 5-7.
Tot voor kort bleef het onbekend of cardiale voorlopercellen uitbreiding witho ondergaanut differentiatie, deels te wijten aan het gebrek aan informatie over hun cellulaire omgeving. Onze recente studie suggereert dat pharynxbogen dienen als een micro-omgeving voor de vernieuwing van het hart en de spieren voorouders en kan gekweekt ex vivo worden over enkele weken 8. Dit explantaat werkwijze biedt een nieuwe en unieke gelegenheid om de ontwikkeling van hart- en craniofaciale progenitoren ex vivo te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze video laten we zien hoe te isoleren en cultuur eerste en tweede pharynxbogen van 9,5 dagen oude muis embryo's. Pharynxbogen zijn van voorbijgaande aard, gesegmenteerd uitstulpingen die op het craniolateral kant van het ontwikkelen van embryo's 9, die multi-potente cardiale voorlopercellen-bouwstenen bevatten om het hart te maken tijdens de embryogenese 10,11 -in tweede bogen en hoofd spieren voorlopers in de eerste bogen 8 verschijnen .
Dissec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).
Materials
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10cm petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 | |
References
- Kelly, R. G. The second heart field. Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
