Summary

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Abstract

La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l'étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d'étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l'aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l'intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l'ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l'utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l'optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l'embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d'une chimère), l'injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés 1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d'agrégats multicellulaires de suspension (corps embryoïdes, EB) dans des milieux contenant du sérum supplémenté avec de l'acide rétinoïque morphogène 2-4. Depuis lors, un grand nombre de protocoles ont été développés pour permettre la différenciation de neurones 5. Beaucoup utilisent encore l'agrégation, d'autres co-culture avec induisant types de cellules et plusieurs impliquent l'utilisation de milieux sans sérum. Tous les protocoles ont des avantages d'une inconvénients et la nature précise des neurones ou des cellules neuronales produites varie également selon le protocole utilisé.

Le protocole idéal serait robuste, évolutive et faire usage des médias et des substrats entièrement définis, se prêter à la surveillance non invasive du processus de différenciation et entraîner la génération de populations pures de progéniteurs neuronaux pouvant être modelée par des indices externes et de différencier dans tous les sous-types neuronales et gliales avec une grande efficacité et le rendement dans un temps relativement court. Dans les douze dernières années, nous avons utilisé une méthode pour générer des progéniteurs neuronaux et les neurones de souris ESC dans une faible densité, la culture de monocouche adhérente sans sérum 6-10. Ce protocole répond à la plupart des critères énoncés ci-dessus: dans nos mains l'efficacité de la différenciation a été assez constante au cours de nombreuses années et une variété de lignées cellulaires, il peut être agrandie ou réduite (nous utilisons avec succès les navires des plaques à 96 puits à 15 cm de diamètre dishes) et les supports utilisés sont bien définis. Le procédé se prête à la microscopie Timelapse pour le contrôle de la différenciation et une variété de structuration indices peuvent être ajoutés pour induire la production de différents types de sous-types de neurones (par exemple, Shh et Fgf8 pour les neurones dopaminergiques 6).

Néanmoins, il ya des défis à l'application réussie de ce protocole. Un des aspects clés est une préparation minutieuse des médias. Nous préparons toujours les médias en interne malgré la disponibilité d'alternatives commerciales. Un des suppléments utilisés (N2; voir le protocole) a plus de modifications à la norme de versions disponibles dans le commerce. Enfin, l'une des étapes les plus importantes pour l'application réussie de cette méthode est la densité cellulaire optimale au placage. Ceci est principalement parce que tandis que la nature autocrine de l'un des signaux induisant (FGF4 11) exige que suffisamment de cellules sont présents pour permettre VIABIL optimalelité et la différenciation, à la différenciation trop élevées des densités de dépréciation (éventuellement en partie due à la production autocrine de FRV 12). Il est donc important que la préparation des deux médias et le placage de cellules sont réalisées avec soin et de manière cohérente afin de garantir des résultats optimaux.

Protocol

1. Préparation des médias NOTE: Le protocole repose sur l'utilisation d'un mélange de deux supports séparés: DMEM / F12 additionné de supplément N2 modifié et Neurobasal additionné de supplément B27, typiquement dans un rapport de 1: 1. Préparer le supplément N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne pas vortex ou filtrer cette; mélanger en inversant le tube jusqu'à ce que la solution est claire. Commencez par pipetage 7…

Representative Results

Dans cette expérience, nous avons utilisé la lignée cellulaire 46C 14, les cellules souches embryonnaires de souris avec une endogène Sox1-GFP journaliste, pour suivre la différenciation neuronale. En utilisant cette lignée cellulaire, l'expression de Sox1, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux, peut être détectée par la fluorescence verte. Placage densité est un facteur critique pour atteindre la différenciation neuronale. Souris des cellules souches embryonnaires ont été étalées da…

Discussion

Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d'une décennie 6. Le protocole est très efficace, composée d'un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l'efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

Materials

Fetal bovine serum Life Technologies 10270-106
DMEM/F12 Life Technologies 11320-074
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01
B-27 Supplement, serum free Life Technologies 17504-044
Insulin Sigma I6634 Reconstitute with sterile 0.01M HCl
Apo-transferrin Sigma T1147 Reconstitute with sterile water
Progesterone Sigma P8783 Reconstitute with ethanol
Putrescine Sigma P5780 Reconstitute with sterile water
Sodium selenite Sigma S5261 Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V Life Technologies 15260-037
L-Glutamine Life Technologies 25030-081 Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine Sigma G1890
6-well tissue culture dish Thermo Scientific 140675
24-well tissue culture dish Thermo Scientific 142475
96-well tissue culture dish Thermo Scientific 167008
GMEM Life Technologies 11710-035
Fetal bovine serum Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids solution Life Technologies 11140-050
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070
2-mercaptoethanol Sigma M7522
Leukaemia inhibitory factor prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20 Sigma P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma D9542 Protect from light
Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody Covance MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody Life Technologies A31571 Protect from light
25cm2 tissue culture flask Thermo Scientific 156367

References

  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
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Cite This Article
Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture. J. Vis. Exp. (99), e52823, doi:10.3791/52823 (2015).

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