Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

Las células madre embrionarias son células pluripotentes derivadas de embrión temprano con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro conservando la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares adulto siguientes reintroducción en un embrión etapa apropiada (mediante la formación de una quimera), la inyección en singénicos o inmunocomprometidos hosts (mediante la formación de un teratoma) o in vitro sujetos a las señales apropiadas ^1. La diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales fue descrita por primera vez en 1995 y consistió en la formación de agregados de suspensión multicelulares (cuerpos embrionarios, EBS) en medios que contienen suero complementado con el ácido retinoico morfógeno ^2-4. Desde entonces una variedad de protocolos han sido desarrollados para permitir la diferenciación neural ^5. Muchos todavía utilizar la agregación, otros co-cultivo con la inducción de tipos de células y varios implican el uso de medios libres de suero. Todos los protocolos tienen ventajas unasnd desventajas y la naturaleza precisa de neural o células neuronales producidas también varía de acuerdo con el protocolo utilizado.

El protocolo ideal sería que robusto, escalable y hacer uso de los medios de comunicación y sustratos completamente definidos, ser susceptibles de monitorización no invasiva del proceso de diferenciación y el resultado en la generación de poblaciones puras de progenitores neurales capaz de ser modelada por las señales externas y para diferenciar en todos los subtipos neuronales y gliales con alta eficiencia y rendimiento en un tiempo relativamente corto. En los últimos doce años hemos estado utilizando un método para generar células progenitoras neuronales y neuronas de ratón CES en una baja densidad, la cultura monocapa adherente sin suero ^6-10. Este protocolo cumple muchos de los criterios establecidos anteriormente: en nuestras manos la eficiencia de diferenciación ha sido bastante constante durante muchos años y una variedad de líneas celulares, se puede escalar hacia arriba o hacia abajo (que utilizamos con éxito buques de placas de 96 pocillos a 15 cm de diámetro diella es) y los medios utilizados están bien definidos. El proceso es susceptible de microscopía timelapse para el seguimiento de la diferenciación y una variedad de señales de modelado puede ser añadido para inducir la generación de distintos tipos de subtipos neuronales (por ejemplo, Shh y Fgf8 para las neuronas dopaminérgicas ^6).

Sin embargo, hay algunos retos para la aplicación exitosa de este protocolo. Uno de los aspectos clave es la preparación cuidadosa de los medios de comunicación. Siempre nos preparamos los medios de comunicación en la empresa a pesar de la disponibilidad de alternativas comerciales. Uno de los suplementos utilizados (N2; véase el Protocolo) tiene modificaciones sobre el estándar versiones disponibles en el mercado. Por último, uno de los pasos más importantes para la aplicación exitosa de este método es la densidad celular óptima en chapado. Esto es principalmente porque mientras que la naturaleza autocrina de una de las señales que inducen (Fgf4 ¹¹⁾ requiere que las células están presentes suficientes para permitir viabil óptimadad y la diferenciación, a muy altas densidades de diferenciación se deteriora (posiblemente en parte debido a la producción autocrina de LIF ^12). Por ello es importante que la preparación tanto de los medios y chapado celular se realizan con cuidado y consistentemente para asegurar resultados óptimos.