Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Modulação do circuito colinérgico excitabilidade contribui para os aspectos fundamentais de cognição, e modulação colinérgica alterada é uma característica de distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricas incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência ^1-4. Um mecanismo estabelecido de facilitação de transmissão sináptica colinérgica no sistema nervoso central é, por activação directa de nAChRs localizadas em locais pré-sinápticos. A activação destes receptores pré-sinápticos leva a um aumento de Ca2 ⁺ intracelular ([Ca ^2+] _i) nos terminais pré-sinápticos – tanto directamente, devido à relativamente elevada condutância de cálcio de certos subtipos de nAChR, e indirectamente, por cascatas de sinalização intracelular ^5, aumentando, assim, a libertação de neurotransmissores. De facto, a activação dos nAChRs pré-sinápticos tem sido associada com mudanças na libertação de uma grande variedade de neurotransmissores, incluindo glutamato, GABA, acetilcolina, umND dopamina ^6-10. Embora este processo tem sido estudada usando métodos electrofisiológicos indirectamente em diversas sinapses, indicadores ópticos de [Ca2 ^+] _i e a reciclagem das vesículas sinápticas permitir uma medição mais directa e temporalmente precisa dos fenómenos pré-sinápticos.

Localização pré-sináptica dos nAChRs foi demonstrada de forma convincente com rotulagem imuno-ouro direta de nAChRs na microscopia eletrônica (EM) nível ^11,12. Várias outras técnicas também têm sido utilizados para tratar a localização do nAChR indirectamente, incluindo a detecção de locais de nAChRs subunit- quimeras de proteína fluorescente em neurónios cultivados ^13,14, electrofisiológico gravação de correntes de nAChR em terminais sinápticos ^15,16, monitorização de nicotina induziu alterações na [Ca ^{2 +]} _i em terminais nervosos sinápticas por imagens ao vivo de células ¹⁷ e monitoramento indireto da liberação do neurotransmissor no terminal sináptico portécnicas de imagem de células vivas com indicadores fluorescentes, incluindo exocitose das vesículas sinápticas vistos por estirilo corantes anfip�icos FM (FM1-43 e FM4-64) e / ou synapto-pHluorin e por repórteres fluorescentes neurotransmissores específicos, como CNiFERs para ACh e iGluSnFr para glutamato ^18-20. No geral, essas abordagens atuais para identificar a localização pré-sináptica dos nAChRs são complicadas e exigem sistemas e técnicas especiais para permitir a identificação confiável e monitorização fisiológica da atividade pré-sináptica.

Aqui nós descrevemos protocolos e equipamentos para um sistema in vitro de co-cultura de um hipocampo ventral (vHipp) – núcleo accumbens (NACC) circuito que fornece acesso direto para identificar e analisar os dois componentes pré e pós-sinápticos de transmissão sináptica. Mostramos exemplos de localização pré-sináptica dos nAChRs ea imagens de células vivas de nAChR mediada sinalização de Ca2 ⁺ e liberação de neurotransmissores aloaxônios ng vHipp. Uma extensão natural (e direta) do protocolo apresentado aqui é a preparação de contatos pré e pós-sinápticos composta de neurônios de diferentes genótipos. Deste modo, a contribuição de um produto de gene em particular para o pré e / ou de mecanismos pós-sinápticos de modulação pode ser avaliada directamente.