Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme
Summary
We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Abstract
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
Introduction
Devre uyarılabilirliğinin Kolinerjik modülasyon biliş temel yönlerine katkıda bulunur ve değişmiş kolinerjik modülasyonu Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, şizofreni ve bağımlılık 1-4 olmak üzere nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların bir özelliğidir. CNS'de sinaptik iletim kolinerjik kolaylaştırılması kurulan bir mekanizma, ön-sinaptik olarak lokalize nAChR'lerin doğrudan aktivasyonu yoluyla olmaktadır. Dolaylı olarak bazı nAChR alt tipleri ve nispeten yüksek kalsiyum iletkenlik hem doğrudan, bağlı ile hücre içi sinyal iletim – bu pre-sinaptik reseptörlerinin aktivasyonu, hücre içi Ca + 2 ([Ca2 +] i) ön-sinaptik terminallerindeki sebep olur 5, bu şekilde nörotransmitter salgılanmasını zenginleştirmek. Aslında, pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyonu da dahil olmak üzere, glutamat nörotransmitterlerin çok çeşitli GABA, ACh, serbest değişikliklerle bağlantılı olan birnd dopamin 6-10. Bu işlem, dolaylı, çeşitli sinapslarda elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenmiştir, ancak optik habercilerin [Ca2 +] i ve sinaptik vezikül dönüştürme pre-sinaptik olayların daha doğrudan ve zamansal olarak hassas ölçümü sağlar.
NAChR'lerin pre-sinaptik lokalizasyon elektron mikroskobik (EM) düzeyinde 11,12 olarak nAChR'lerin doğrudan bağışıklık altın etiketleme ile ikna edici kanıtlanmıştır. Birkaç diğer teknikler de kültürlü nöronlar 13,14 nAChRs subunit- floresan protein kimeralar yerleri tespit da dahil olmak üzere, dolaylı nAChR yerelleştirme hitap için kullanılır olmuştur, sinaptik terminallerde 15,16 yılında nAChR akımların elektrofizyolojik kayıt, [içinde Ca nikotin kaynaklı değişiklikleri izleme sinaptik terminalinde canlı hücre görüntüleme 17 ve nörotransmitter salınımı dolaylı izlenmesi sinaptik sinir terminallerinde 2 +] istiril amfipatik FM boyalar (FM1-43 ve FM4-64) ve / veya synapto-pHluorin ve bu tür glutamat ACH ve iGluSnFr için CNiFERs gibi özel flüoresan nörotransmiter muhabir, tarafından izlendi sinaptik veziküllerin ekzositozu de dahil olmak üzere, floresan göstergesi olan canlı hücre görüntüleme teknikleri 18-20. Genel olarak, nAChR'lerin pre-sinaptik localisation belirlenmesi için, bu mevcut yaklaşımlar karmaşıktır ve güvenilir bir kimlik ve pre-sinaptik aktivitenin fizyolojik izleme sağlamak için özel bir sistem ve teknikler gerektirir.
Belirlemek ve sinaptik iletim öncesi ve post-sinaptik bileşenleri hem de analiz doğrudan erişim sağlayan nükleus akumbens (NACC) devre – Burada bir ventral hipokampal (vHipp) in vitro ko-kültür sistemi protokolleri ve ekipmanlar açıklar. Biz pre-sinaptik nAChR'lerin lokalizasyonu ve Ca 2 + sinyalizasyon ve nörotransmitter bırakma alo aracılı nAChR'nin canlı hücre görüntüleme örneklerini göstermektedirng vHipp aksonlar. Burada sunulan protokol doğal (ve basit) uzantısı farklı genotipleri gelen nöronların oluşan öncesi ve post-sinaptik temasların hazırlanmasıdır. Bu şekilde, modülasyon öncesi ve / veya post-sinaptik mekanizma belirli bir gen ürününün katkı, doğrudan tespit edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ko-kültür hazırlanması açıklanan yeniden taahhüt eder in vitro ventral hipokampal-accumbens devreleri. pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyon glutamaterjik iletimi 5, 21 gelişmiş ortaya çıkaran hangi mekansal ve zamansal profillerin Bu preparat izin oldukça basit ve güvenilir bir sınav.
Co-kültürlerinde in vivo benzeri işlev göstermek için, in vitro olarak fizyolojik koşulları sağlayan bir çanak içinde farklı spesifik h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
Materials
| 1, Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O’Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. . Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
