산화 DNA 바이오 마커의 HPLC 측정, -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신, 배양 세포와 동물 조직
Summary
이 프로토콜의 목적은 DNA 산화 마커의 검출이다 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA (8 옥소 dGuo) HPLC-ED 의해.
Abstract
산화 스트레스는 DNA를 포함한 생체 거대 분자의 산화로 이어지는 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정뿐만 아니라, 생체 이물 대사와 관련된다. 따라서, DNA의 산화를 효율적으로 검출은 의학 및 독성학 연구 분야를 포함한 다양한 중요하다. 산화 적 DNA 손상의 일반적인 바이오 마커는 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신 (8 옥소 dGuo이다 종종 잘못이라 -8- 하이드 록시 -2'- 데 옥시 구아노 신 (8-OH-dGuo 8 옥소 – DG)). 전기 화학적 검출 (HPLC-ED)와 고압 액체 크로마토 그래피로 -8- 옥소 dGuo 측정을위한 여러 프로토콜들이 설명되었다. 그러나, 이들은 주로 산화 촉진제로 처리 DNA 정제에 적용 하였다. 또한, 때문에 주로 분석 장비의 차이에 실험실 사이의 방법 론적 차이에, HPLC-ED 8 옥소 dGuo의 검출을위한 공개 방법의 채택은 각 실험실에 의해 조심 최적화가 필요합니다.이러한 최적화 과정을 설명하는 포괄적 인 프로토콜은 결여되어있다. 여기서, 상세한 프로토콜은 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA에 의해 HPLC-ED -8- 옥소 dGuo의 검출에 대하여 설명한다. 이는 DNA 샘플 제조 용이하고 신속하게 샘플 제조 동안 발생할 수있는 바람직하지 않은 DNA의 산화를 최소화하기 위해 최적화 될 수있는 방법을 예시한다. 이 프로토콜은 산화제 KBrO 3 처리 배양 된 폐포 선암 세포 (즉, A549 세포)에 -8- 옥소 dGuo를 검출하고, 다환 방향족 탄화수소 디 벤조 (DEF, P) 크리 센에 노출 된 마우스의 비장에서하는 방법을 보여준다 (구 디 벤조 (A, L) 피렌로 알려진 DBC, DalP). 전반적으로,이 작품은 HPLC-ED의 방법론은 쉽게 생체 시료 8 옥소 dGuo의 검출에 최적화 할 수있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
누구의 정상 상태 수준의 많은 병리학 적 조건 xenotoxic 대사 중에 증가 할 수 반응성 산소 종 (ROS)는, 산화 DNA 손상의 빈도 증가에 기여한다. 여러 가지 뉴 클레오 산화 생성물 중 산화성 DNA 손상이 용이하게 안정 마커를 사용하여 측정 할 수 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신 (2)의 산화 된 형태 중 하나이다 (8- 옥소 dGuo) ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. -8- 옥소 dGuo 따라서, 여러 DNA 산화 생성물 (3)의 존재에도 불구하고 DNA 산화 등의 바이오 마커에 더 상세히 연구되어, 가장 풍부한 DNA 병변 2이고. 인간에있어서, 이러한 손상은 8 oxoguanine 글리코 1 (hOGG1) (4)에 의해 염기 절제 복구를 통해 복구 될 수있다. 수리되지두면 -8- 옥소 dGuo베이스 페어 치환 돌연변이의 형성 (즉, G는 transversions를 T로)에 기여할 수있다 (4). 중요한 -8- 옥소 dGuo은 확립 마커 FO는시작과 암 발생이 촉진 관련 R의 DNA 손상. 따라서 -8- 옥소 dGuo의 정확한 정량화는 산화 적 DNA 손상 (5)의 유용하고 바람직한 바이오 마커이다.
또한, 화합물 (들)의 정확한 이름 일상적 산화성 DNA 손상 (6)의 바이오 마커로서 측정 산화 손상-2- 데 옥시 구아노 형태 및 대한 정확한 명칭에 관한 문헌에서 광범위 혼란이있다. -8- 옥소 dGuo (도 1에 도시)의 6,8- 디케 및 6- 에놀 8 케토 호변 이성질체 형태는 문헌에서 논의 5,7- 개의 가장 두드러진 호변이다. 6,8- 디케 형태는 7.4의 생리 학적 pH에서 가장 두드러진 형태이고, 가장 눈에 띄는 DNA 산화 생성물 7이다. 따라서 -8- 옥소 dGuo가 아닌 8- 히드 록시 dGuo이 산화 생성물 (6)에 대해 가장 적절한 이름이다. 그것은 오히려 nucleob보다, 그 2 구아노 (dGuo)을주의하는 것이 중요하다ASE의 구아닌 (GUA) 또는 리보 구아노 신 (구오)는 각각 대부분의 방법 (6)에 의해 검출된다.
정확한 검출 및 -8- 옥소 dGuo의 정량화 인해 도전 : DNA 샘플의 소화 I)의 변동, ⅱ) 외래성 샘플 제조 동안 발생할 수 -8- 옥소 dGuo에 dGuo의 산화, 및 ⅲ) 필요 분석 HPLC-ED 방법 (8)의 효과 검증을위한. 이 프로토콜에서, 우리는 완전한 DNA 소화에 유리 및 II) 함유 금속 킬 레이터 및 킬 레이터 처리 용액 및 특별한 DNA 분리 용 시약에 의해 ⅲ) 부분적으로 만의 포함에 의해 해결되는 동안의 조건을 제공함으로써 i)를 달성하는 것을 목표 양성 대조군은 따라서 방법은 생물학적 샘플에서 -8- 옥소 dGuo를 검출 할 수있는 것을 제공한다. 또한 검증은이 문서의 범위를 벗어납니다. 그러나, 우리는이 프로토콜은 미래의 도움이 될 것으로 확신한다사용자들은 그들 자신의 정식 목적에 따라 프로토콜을 검증 할 필요가있는 범위를 결정한다. 방법의 형식적인 검증을 위해 필요한 단계의리스트를 더 제공된다. 8 옥소 dGuo 검출을위한 방법의 개발 및 배포하는 동안, 출판 방법을 검토하고 통합했다. 따라서,이 방법은 8 옥소 dGuo의 검출 및 정량 방법을 성공적으로 채택되어있는 경우도 시험을 신속하고 간단한 방법을 제공하는 동시에 자주 중요한 실험 세부 결여 여러 공개 소스로부터 정보를 수집 할 필요가 없다. 이 적응 방법은 성공적으로 배양 된 세포 및 조직에서 쥐의 DNA 시료를 분석하는 데 이용 하였다. 이 비디오 기사는 HPLC-ED에 의해 신뢰할 수있는 탐지 및 8 옥소 dGuo의 정량화를위한 효과적인 방법을 확립 다른 그룹에 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
8 옥소 dGuo이 DNA의 산화의 유용한 바이오 마커로보고되었지만, 그것의 신뢰성 정량화 도전을 제기 할 수 있습니다. 여러 게시 방법이 존재하지만, 자신의 실험실에서 방법을 배포하는 연구자를 허용하는 프로토콜의 포괄적 인 개요 설명이 필요하다. 여기서 우리는 -8- 옥소 dGuo 검출 및 정량화를위한 효과적인 방법을 확립하기위한 새로운 사용자를 허용 할 것이다 HPLC 기반 프로토콜의 상세한 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 보건부 유전체학 연구 개발 이니셔티브 (GRDI)과 생명 공학에 대한 캐나다의 규제 전략 (CRSB)에 의해 투자되었다. 저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
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