HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא הגילוי של סמן חמצון ה- DNA, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo) על ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים.
Abstract
סטרס חמצונים קשור הרבה תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם חילוף חומרים xenobiotic, מוביל לחמצון של Biomacromolecules, כולל DNA. לכן, זיהוי יעיל של חמצון ה- DNA הוא חשוב עבור מגוון רחב של תחומי מחקר, כוללים רפואה וטוקסיקולוגיה. סמן ביולוגי משותף של דנ"א פגום oxidatively הוא 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo; לעתים קרובות מכונה בטעות כ8-הידרוקסי-2'deoxyguanosine (8-OH-dGuo או 8 -oxo-DG)). כמה פרוטוקולים ל8-אוקסו-dGuo מדידה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ED) תוארו. עם זאת, אלה יושמו בעיקר ל- DNA מטוהר שטופל בפרו-חמצון. בנוסף, עקב הבדלים מתודולוגיים בין מעבדות, בעיקר בשל הבדלים בציוד אנליטי, האימוץ של שיטות שפורסמו לצורך זיהוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED דורש אופטימיזציה זהירה בכל מעבדה.פרוטוקול מקיף, המתאר תהליך האופטימיזציה כזה, חסר. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לגילוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים. זה מדגים כיצד הכנת דגימת DNA יכולה להיות מותאמת בקלות ובמהירות כדי למזער חמצון ה- DNA לא רצוי שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם. פרוטוקול זה מראה כיצד לזהות 8-אוקסו-dGuo בתאים בתרבית אדם אדנוקרצינומה מכתשי (כלומר, תאי A549) שטופלו בסוכן חמצון KBrO 3, ומהטחול של עכברים שנחשפו לdibenzo פחמימנים ארומטיים polycyclic (def, עמ ') chrysene (DBC, שנקרא בעבר פיר dibenzo (, יב), DalP). בסך הכל, עבודה זו מדגימה כיצד מתודולוגיה HPLC-ED יכולה להיות מותאמת בקלות לזיהוי של 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות.
Introduction
מינים תגובתי חמצן (ROS), מצב יציב שיכולים להגדיל את הרמות בהרבה מצבים פתולוגיים וחילוף חומרי xenotoxic, תורמים לשכיחות מוגברת של נזק לדנ"א חמצוני. בין כמה מוצרי חמצון nucleobases האפשרי, נזק לדנ"א חמצוני יכול בקלות למדוד באמצעות הסמן היציב 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo), שהוא אחת מצורות חמצון של 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-אוקסו-dGuo הוא נגע DNA הנפוץ ביותר 2, ולכן, כבר למד לפירוט רב יותר כסמן ביולוגי חמצון ה- DNA למרות קיומם של מוצרי חמצון ה- DNA המרובים 3. בבני אדם, נזק זה ניתן לתיקון באמצעות תיקון כריתת בסיס על ידי glycosylase 8-oxoguanine 1 (hOGG1) 4. אם עזב מתוקן, 8-אוקסו-dGuo יכול לתרום להיווצרותן של מוטציות זוג-החלפת בסיס (כלומר, G לT transversions) 4. חשוב לציין, 8-אוקסו-dGuo הוא סמן הוקם FOנזק לדנ"א r ביחס לייזום והקידום של היווצרות הסרטן 2. לכן, כימות מדויק של 8-אוקסו-dGuo הוא סמן ביולוגי שימושי ורצוי של נזק לדנ"א חמצוני 5.
יש בלבול נפוץ בספרות בנוגע לשמות הנכונים לצורות oxidatively פגועות של 2-deoxyguanosine ו, יתר על כן, את השם הנכון של המתחם (ים) שנמדדו באופן שגרתי כסמן ביולוגי של נזק לדנ"א חמצוני 6. צורות tautomeric 8-קטו 6,8-diketo ו6-enol, של 8-אוקסו-dGuo (מוצג באיור 1) הן שני tautomers הבולט ביותר שנדון בספרות 5,7. טופס 6,8-diketo הוא הצורה הבולטת ביותר ב- pH הפיזיולוגי של 7.4, והוא מוצר חמצון ה- DNA הבולט 7. לכן, 8-אוקסו-dGuo, במקום 8-הידרוקסי-dGuo הוא השם המתאים ביותר למוצר חמצון זה 6. כמו כן, חשוב לשים לב ש2-deoxyguanosine (dGuo), ולא nucleobגואנין ASE (גואה) או guanosine ribonucleoside (גואו), בהתאמה, הוא זוהה על ידי רוב השיטות 6.
איתור וכימות של 8-אוקסו-dGuo מדויקים הוא מאתגר עקב: השתנות i) בעיכול של דגימת DNA, ii) חמצון adventitious של dGuo 8-אוקסו-dGuo שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם, וiii) את הצורך לאימות יעילה של שיטת HPLC-ED אנליטיים 8. בפרוטוקול זה, אנו חותרים להשגת i) על ידי מתן תנאים, נוחים לעיכול DNA מלא וii) על ידי chelator הכללת המתכת ופתרונות שטופל chelator ומגיב בידוד-דנ"א מיוחד, תוך iii) היה ממוען רק באופן חלקי על ידי הכללת בקרות חיוביות וכך לספק כי השיטה היא מסוגלת לאתר 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות. אימות נוספת היא מעבר להיקף של מאמר זה. עם זאת, אנו בטוחים כי פרוטוקול זה יעזור לי פוטנציאלימשתמשים לקבוע את המידה שבה הם צריכים לאמת באופן רשמי בפרוטוקול, בהתאם לצרכיהם. רשימה של צעדים הנדרשים לאימות הפורמאלית של השיטה מסופקת נוספת. במהלך הפיתוח והפריסה של שיטה לזיהוי 8-אוקסו-dGuo, שיטות שפורסמו נסקרו ומאוחדת. לכן, שיטה זו מבטלת את הצורך לאסוף מידע ממספר מקורות שפורסמו, כי לעתים קרובות חסרי פרטים ניסיוניים חשובים גם בעת מתן אמצעי מהיר ופשוט של בדיקות אם השיטה לאיתור והכימות של 8-אוקסו-dGuo כבר אימצה בהצלחה. שיטה מותאמת זה הועסקה לנתח בהצלחה דגימות DNA מהתאים בתרבית רקמה ועכברית. מאמר זה וידאו יסייע קבוצות אחרות בהקמת שיטה יעילה לגילוי אמין וכימות של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות 8-אוקסו-dGuo דווח כסמן ביולוגי שימושי של חמצון ה- DNA, הכימות אמין שלה יכול להוות אתגר. למרות כמה שיטות שפורסמו קיימות, יש צורך בסקירה מקיפה, תיאורים של פרוטוקול להתיר לחוקרים לפרוס את השיטה במעבדות שלהם. כאן אנו מציגים סקירה מפורטת של פרוטוקול מבוסס HPLC שיאפשר למשתמש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי משרד הבריאות הקנדית ג'נומיקס המחקר ופיתוח היוזמה (GRDI) ותקינת האסטרטגיה הקנדית לביוטכנולוגיה (CRSB). יש הסופרים אין ניגוד האינטרסים.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
