HPLC قياس الحمض النووي الأكسدة العلامات البيولوجية، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine، في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن الحمض النووي الأكسدة علامة، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo) من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية.
Abstract
ويرتبط الاكسدة مع العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، وكذلك التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا، مما يؤدي إلى أكسدة الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك الحمض النووي. ولذلك، كشف الفعال للأكسدة الحمض النووي مهم لمجموعة متنوعة من التخصصات البحثية، بما في ذلك الأدوية والسموم. A العلامات البيولوجية المشتركة للأضرار الحمض النووي oxidatively هو 8-أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo، غالبا ما يشار إليها باسم خطأ 8-هيدروكسي-2'-deoxyguanosine (8-OH-dGuo أو 8 -oxo-DG)). وقد وصفت عدة بروتوكولات لقياس 8 أوكسو dGuo ارتفاع ضغط اللوني السائل مع كشف الكهروكيميائية (HPLC-ED). ومع ذلك، طبقت هذه أساسا لDNA تنقية تعامل مع الموالية للتأكسد. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلافات المنهجية بين المختبرات، ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في المعدات التحليلية، واعتماد أساليب نشرت للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED يتطلب التحسين دقيق من قبل كل مختبر. Aبروتوكول شامل، واصفا مثل هذه العملية الأمثل، غير متوفرة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية. فإنه يوضح كيفية إعداد عينة من الحمض النووي يمكن بسهولة وبسرعة الأمثل لتقليل أكسدة الحمض النووي غير المرغوب فيها التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات. ويظهر هذا البروتوكول كيفية اكتشاف 8 أوكسو dGuo في الخلايا المستزرعة الإنسان غدية السنخية (أي الخلايا A549) تعامل مع عامل مؤكسد KBrO 3، ومن الطحال من الفئران المعرضة للثنائي بنزو الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (صفر، ع) chrysene (DBC، المعروف سابقا باسم بنزو (أ، ل) بيرين، DalP). عموما، يوضح هذا العمل كيف منهجية HPLC-ED يمكن أن يكون الأمثل بسهولة للكشف عن 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية.
Introduction
تساهم أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الذي مستويات ثابتة للدولة يمكن أن تزيد خلال العديد من الحالات المرضية والتمثيل الغذائي xenotoxic، إلى زيادة وتيرة الحمض النووي من التلف التأكسدي. بين عدة النووية nucleobases الممكنة منتجات الأكسدة، ويمكن أن الحمض النووي من التلف التأكسدي بسهولة أن تقاس باستخدام علامة مستقرة 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo)، التي تعد واحدة من أشكال المؤكسد من 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-أوكسو dGuo هو آفة DNA الأكثر وفرة 2، وبالتالي، وقد درس لمزيد من التفاصيل والعلامات البيولوجية أكسدة الحمض النووي على الرغم من وجود الحمض النووي عدة منتجات الأكسدة 3. في البشر، وهذا الضرر يمكن إصلاحه عن طريق قاعدة إصلاح الختان بنسبة 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. إذا تركت دون إصلاح، ويمكن 8 أوكسو dGuo المساهمة في تشكيل قاعدة الطفرات الزوج إحلال (أي G إلى T transversions) 4. الأهم من ذلك، 8 أوكسو dGuo هو علامة المنشأة FOالحمض النووي من التلف (ص) في ما يتعلق استهلال وتعزيز التسرطن 2. ولذلك التقدير الدقيق 8 أوكسو dGuo هو العلامات البيولوجية مفيدة ومرغوبة من الحمض النووي من التلف التأكسدي 5.
هناك ارتباك واسع النطاق في الأدبيات المتعلقة الأسماء الصحيحة لأشكال تلف oxidatively ل2-deoxyguanosine وعلاوة على ذلك، والاسم الصحيح للمجمع (ق) تقاس بشكل روتيني والعلامات البيولوجية من الحمض النووي من التلف التأكسدي 6. من 6،8-diketo و 6 إنول، 8-كيتوني أشكال صنواني من 8 أوكسو dGuo (كما هو موضح في الشكل رقم 1) هما tautomers أبرز مناقشتها في الأدب 5،7. شكل 6،8-diketo هو الشكل الأبرز في درجة الحموضة الفسيولوجية 7.4، و هو الأبرز أكسدة الحمض النووي المنتج 7. لذا، 8 أوكسو dGuo، بدلا من 8 هيدروكسي dGuo هو الاسم الأنسب لهذا المنتج أكسدة 6. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن 2-deoxyguanosine (dGuo)، بدلا من nucleobبورصة عمان جوانين (غواتيمالا) أو غوانوزين ريبونوكليوزيد (قوه) على التوالي، تم الكشف من قبل معظم وسائل 6.
كشف دقيق وتقدير من 8 أوكسو dGuo يمثل تحديا للأسباب التالية: أ) التباين في الهضم من عينة من الحمض النووي، والثاني) الأكسدة عرضية من dGuo إلى 8 أوكسو dGuo التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات، والثالث) الحاجة للتحقق من صحة الفعال للالتحليلي طريقة HPLC-ED 8. في هذا البروتوكول، ونحن تهدف إلى تحقيق ط) من خلال توفير الظروف المواتية لاستكمال عملية الهضم DNA والثاني) من قبل خالب إدراج المعدن وحلول المعالجة خالب وكاشف عزل DNA الخاص، في حين أن الثالث) كانت موجهة جزئيا فقط إدراج الضوابط الإيجابية، وبالتالي تنص على أن الأسلوب هو قادر على اكتشاف 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية. مزيد من التأكيد هو أبعد من نطاق هذه الورقة. ومع ذلك، فإننا واثقون من أن هذا البروتوكول سوف تساعد المحتملينالمستخدمين على تحديد المدى الذي يحتاجون إليه للتحقق من صحة رسميا البروتوكول، حسب أغراضها. وهناك قائمة من الخطوات المطلوبة للمصادقة رسمية من طريقة أخرى. خلال تطوير ونشر طريقة للكشف عن 8 أوكسو dGuo، تم استعراض أساليب نشر وتوحيدها. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى جمع المعلومات من عدة مصادر منشورة التي تفتقر في كثير من الأحيان تفاصيل التجريبية مهمة بينما توفر أيضا وسيلة سريعة ومباشرة من اختبار إذا تم اعتماد أسلوب للكشف وتقدير من 8 أوكسو dGuo بنجاح. كان يعمل هذا الأسلوب تكييفها لتحليل عينات من الحمض النووي بنجاح من الخلايا المستزرعة والأنسجة الفئران. هذه المقالة الفيديو سوف تساعد مجموعات أخرى في إنشاء وسيلة فعالة للكشف عن موثوقة وتقدير من 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن 8 أوكسو dGuo تم الإبلاغ عن العلامات البيولوجية مفيدة للأكسدة الحمض النووي، يمكن تقدير لها موثوق تحديا. على الرغم من أن العديد من الطرق التي نشرت موجودة، وهناك حاجة ل، نظرة عامة وصفية شاملة للبروتوكول للسماح للباحثين لنشر الأسلوب في مختبراتهم. نحن هنا تق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مبادرة وزارة الصحة الكندية الجينوم بحوث والتنمية (GRDI) والاستراتيجية التنظيمية الكندية للتكنولوجيا الحيوية (CRSB). الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
