Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine schwächende Erkrankung der Motoneuronen mit dem Verlust der beiden oberen und unteren motorischen Neuronen und damit Muskellähmung. Nach der Diagnose, ist das Überleben des Patienten auf nur 2-5 Jahren durchschnittlich 1. Zwerchfell Motor Neuron (PhMN) Verlust ist ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese der ALS. Patienten sterben schließlich durch den Verlust von PhMN Innervation der Membran, dem primären Muskelinspirations 2,3. Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist auch ein ernstes Problem im Zusammenhang mit Atembeschwerden. Etwa 12.000 neue Fälle von SCI treten jedes Jahr 4 aufgrund traumatischer Schädigung des Rückenmarks. Trotz Krankheit Heterogenität in Bezug auf Standort, Art und Schwere, die Mehrheit der SCI Fälle betreffen Trauma des zervikalen Rückenmarks, die oft zu einer schwächenden und anhaltenden Atem Kompromiss. Neben der ALS und SCI, anderen zentralen Nervensystems (ZNS) Erkrankungen können w zugeordnet werdenith Zwerchfellatemstörungen 5,6.
Die Zwerchfellnerv ist ein efferenten motorischen Nerven, die die ipsilateral Hemi-Diaphragma innerviert und stammt aus PhMN Zellkörper in den C3-C5 Ebenen des ipsilateralen Halsmark entfernt. PhMN Ausgang durch absteigend bulbospinal Eingang aus dem Hirnstamm in einem Gebiet wie dem rostralen ventralen respiratorischen Gruppe (rVRG) 7 bekannt gesteuert. Die rVRG-PhMN Membran Schaltung ist zentral für die Steuerung der inspiratorischen Atmung, sowie andere nicht-Ventilationsmembran Verhaltensweisen. Verschiedene traumatischen Verletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Schaltungen beeinflussen können, um eine tiefgreifende Rückgang der Lungenfunktion und Lebensqualität der Patienten führen. Nder Eingabe in PhMNs vom rVRG, PhMN Überleben, Phrenicus Integrität und korrekte Innervation am Diaphragma neuromuskulären Synapse (NMJ) sind alle für den normalen Membran-Funktion notwendig. Es ist daher wichtig, Techniken zu verwenden, dassquantitativ zu bewerten diese Schaltung in vivo in Tiermodellen von ALS, SCI und anderen ZNS-Erkrankungen.
Mit diesem Protokoll ist das Ziel, experimentelle Instrumente zur Bewertung PhMN Innervation des Zwerchfells sowohl auf der elektrophysiologischen und morphologischen Ebenen zu beschreiben. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) werden durch die Stimulierung alle efferenten motorischen Neurons Axone eines bestimmten motorischen Nerven und dann die Analyse der hervorgerufenen Depolarisation Reaktion der Ziel Muskelfasern aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann in vivo bei anästhesierten Ratten und Mäuse verwendet werden, um funktionelle Innervation des Hemidiaphragma durch PhMNs 8 quantifizieren. Aufgrund der Tatsache, dass CMAPs repräsentieren gleichzeitige Aufnahme aller (oder zumindest viele / die meisten) der Muskelfasern der gesamte Hemi-Membran ist es sinnvoll, auch die Phänotypen der einzelnen Motor Axonen und Muskelfasern an der Membran NMJ untersuchen, um Krankheit zu verfolgen – und therapierelevanten morphologischen Veränderungen, wie beispielsweise Teil und complete Denervierung, regenerative Sprießen und Reinnervation. Dies kann über ganze-mount Immunhistochemie (IHC) der Membran erreicht werden, gefolgt von detaillierten morphologischen Bewertung der einzelnen NMJs ganzen Muskel 9. Die Kombination CMAPs und NMJ Analyse bietet eine leistungsstarke Ansatz zur quantitativen Studium Zwerchfell Innervation in Nagetiermodellen von ZNS und PNS Krankheit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als Atemfunktion wird sowohl traumatischen SCI und ALS beeinträchtigt, die Entwicklung von Therapien, die Atmung und speziell Membran Innervation Ziel sind klinisch relevante 5,6. Um die Atemfunktion umfassend zu studieren, sollte ein kombinierter Ansatz Methode verwendet werden. CMAPs messen den Grad der funktionellen Innervation des Zwerchfells durch externe Zwerchfellnervenstimulation, aber nicht endogenen bulbospinal Atemantrieb 8. Hinzu kommt, dass diese Aufnahmen nicht zur Untersuchung von m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
