הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) היא מחלה הנוירון המוטורי מתישה הקשורים לאובדן של שני נוירונים מוטוריים העליונים ותחתונים ושיתוק שריר הסוגר. לאחר האבחון, הישרדות חולה היא בממוצע רק 2-5 שנים 1. אובדן הנוירון מוטורי (PhMN) הסרעפת הוא מרכיב קריטי של פתוגנזה של ALS. חולי סופו של דבר למות כתוצאה מאובדן עצבוב PhMN של הסרעפת, השריר העיקרי של ההשראה 2,3. פגיעה בחוט השדרה טראומטית (SCI) היא גם בעיה רצינית עם קשיי הנשימה קשורים. כ -12,000 מקרים חדשים של SCI להתרחש בכל שנה 4 בשל נזק טראומטי לחוט השדרה. למרות ההטרוגניות מחלה ביחס למיקום, סוג וחומרה, רובם של המקרים SCI כרוכים טראומה לחוט השדרה הצווארי, אשר לעתים קרובות תוצאות פשרה נשימה מתישה ומתמשכת. בנוסף לALS וSCI, מערכת עצבים מרכזית אחרת יכולות להיות קשורות למחלות (CNS) wתפקוד לקוי של ה- i סרעפתי נשימה 5,6.
עצב הסרעפת הוא עצב מוטורי efferent שמעצבב חמי-סרעפת ipsilateral ושמקורו מגופי תא PhMN ממוקמים ברמות C3-C5 של חוט השדרה הצווארי ipsilateral. פלט PhMN נשלט על ידי יורד קלט bulbospinal מגזע המוח באזור המכונה הקבוצה מקורי הגחון הנשימה (rVRG) 7. מעגל rVRG-PhMN-הסרעפת הוא מרכזי לשליטה של נשימת שאיפה, כמו גם התנהגויות סרעפת אינן נשימתית אחרות. פציעות שונות טראומטיות והפרעות ניווניות המשפיעות על מעגלים זה יכולים להוביל לירידה עמוקה בתפקוד נשימה ואיכות חיי מטופל. יורד קלט לPhMNs מהישרדות rVRG, PhMN, יושרת עצב הסרעפת והעצבוב נכון בצומת העצבית-שרירית סרעפת (NMJ) הם כל נחוצים לתפקוד סרעפת נורמלי. לכן חשוב להעסיק טכניקות שכמותית יכול להעריך מעגל זה in vivo במודלים של מכרסמים של ALS, SCI ומחלות של מערכת העצבים המרכזית אחרות.
עם פרוטוקול זה, המטרה היא לתאר בכלים ניסיוניים להערכת עצבוב PhMN של הסרעפת בשני אלקטרו והרמות מורפולוגיים. פוטנציאל פעולת שרירים מתחם (CMAPs) נרשם על ידי גירוי כל האקסונים הנוירון מוטורי efferent של עצב מוטורי נתון ולאחר מכן לנתח את תגובת שלילת קוטביות שהושרו של myofibers היעד. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo בחולדות ועכברים מורדמים לכמת עצבוב תפקודי של חמי-הסרעפת על ידי PhMNs 8. בשל העובדה שCMAPs מייצג הקלטה בו זמנית של כל (רב לפחות או / ביותר) myofibers של כל חמי-סרעפת, זה שימושי גם לבחון את פנוטיפים של אקסונים פרט מנוע וmyofibers בNMJ הסרעפת כדי לעקוב אחר מחלה – ושינויים מורפולוגיים טיפול רלוונטי כגון חלקי ומכלוליםdenervation te, צמיחה והתחדשות reinnervation. זה יכול להיות מושלם באמצעות אימונוהיסטוכימיה כל הר (IHC) של הסרעפת, ואחרי הערכת מורפולוגיות מפורטת של NMJs הבודד לאורך השריר 9. שילוב CMAPs וניתוח NMJ מספק גישה רבת עוצמה לכמותית לומד עצבוב סרעפת במודלים של מכרסמים של המחלה של מערכת העצבים המרכזית וPNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפונקציה נשימה נפגעת בשני SCI הטראומתי וALS, פיתוח טיפולים המתמקדים בנשימה ובאופן ספציפי עצבוב סרעפת קליני רלוונטיים 5,6. כדי ללמוד לתפקד בדרכי הנשימה באופן מקיף, יש להשתמש בשיטת גישה משולבת. CMAPs למדוד את מידת העצבוב התפקודי של הסרעפת בדרך של גירוי עצב הסרעפת חיצונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
