Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
ההיפוקמפוס ממלא תפקיד חשוב בזיכרון ולמידה, כמו גם התנהגות רגשית. פונקציה העיקרית אחת מורכבת מהאיחוד של זיכרון לטווח קצר לזיכרון לטווח ארוך, אשר דורש גמישות גבוהה של מערכת העצבים. Gyrus המשונן של ההיפוקמפוס פועל כשער העיקרית למידע קלט, והוא גם אחד משני אזורים במוח עם neurogenesis המתמשכת לאורך בגרות 1,2. הפיתוח של המבנה בהיפוקמפוס מתרחש במהלך עובר מאוחר ובמיוחד בלידה 3 עד 4 שבועות הראשון 3. במהלך ההתפתחות המוקדמת של המשונן gyrus בריכת תאי גזע הוקמה דרושה ללידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים 4. נוירונים פיתוח עוברים דרך שלבים שונים, מתאי הגזע דרך מספר שלבים של תאי אב ללא בשלה ולבסוף נוירון הבוגר במהלך לידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים. בשלבים שונים של neurogenesis הביטוי שלגנים ספציפיים נדרש כדי לאפשר ההבשלה ואינטגרציה של נוירונים חדשים לתוך המעגלים בהיפוקמפוס 5,6.
שימוש בגנטיקת עכבר וניתוח הפנוטיפ על ידי אימונוהיסטוכימיה כמו גם שיטות מולקולריות אפשר הגדרת דפוס ביטוי ותפקודם של רבים מהגנים האלה. בניתוח microarray בנוסף, כמו גם immunoprecipitation הכרומטין (שבב) סיפק מידע על גני מטרה ישירים ועקיפים פוטנציאל 7,8. עם זאת, יש עדיין שאלות רבות פתוחות בנוגע למנגנוני הרגולציה של פיתוח בהיפוקמפוס, בפרט הפיתוח של הגירוס המשונן. כדי להשיג תובנה נוספת כיצד גנים מסוימים מוסדרים מערכת נדרש המאפשרים המניפולציה של מספר קטן של תאים על ידי למטה או למעלה-רגולציה של הגן של ריבית ו / או גני המטרה שלה ולעקוב אחרי גורלם בפיתוח. ברחם electroporation של shRNAs, cDNA של גנים של עניין או recombina Crese מספק כלי כזה. כדי להבטיח את הנוכחות של פלסמידים ביטוי ה- DNA הרצוי או RNA הקטן אמורים לשמש עבור electroporation. גישה זו מיושמת בהצלחה רבה בלימוד פיתוח קליפת המוח 9,10, אך היא גישה מאתגרת יותר בוחנת את התפתחות gyrus המשונן בשל המיקום של המבנים בהיפוקמפוס בשכבות עמוקות יותר במוח.
electroporation ברחם לשעבר ואחריו התרבות הפרוסה organotypic הוא גישה אחת לעקוף בעיה זו 11,12. בניגוד לelectroporation ברחם לא כל העובר אלא רק את הראש משמש מאפשר לכן להציב את האלקטרודות באופן חיובי יותר לכוון את shRNA / DNA להיפוקמפוס והגירוס המשונן. הקבוצה שלנו מועסקות בהצלחה electroporation לשעבר הרחם כדי ללמוד את התפקיד של גורם שעתוק Bcl11b במהלך פיתוח gyrus המשונן 8. יש Bcl11b תפקיד כפול בפיתוח gyrus המשונן על ידי regulating התפשטות תאי אב, כמו גם בידול כפי שהודגם על ידי אימונוהיסטוכימיה. כדי להגדיר מנגנון למעורבות Bcl11b בתהליכים אלה נוספים, פרוטוקולים של קבוצת Polleux 11,12 הותאמו ללמוד gyrus המשונן כמתואר להלן בסעיף הפרוטוקול. בגישה ראשונה השאלה הופנתה אם Bcl11b הוא מסדיר תא התמיינות תאים עצבי אוטונומית. גישה שנייה בדקה האם Desmoplakin, גן המטרה ישיר של Bcl11b, די בכך כדי להציל את הפנוטיפ Bcl11b.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש היפוקמפוס תפקיד חשוב בלמידה וזיכרון. Gyrus המשונן הוא גם אחד משני אזורים במוח שבו neurogenesis מתרחשת לא רק בפיתוח, אלא גם בבגרות. לאחר לידה ותמורת neurogenesis היפוקמפוס מבוגרת באופן דומה מעורב גורמים משותפים רבים. הגדרת מנגנוני הפיקוח של גורמים אלה יהיו מועילות מאוד בהבנת מחל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
