Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
L'ippocampo gioca un ruolo importante nella memoria e dell'apprendimento e comportamento emotivo. Una funzione principale consiste consolidamento della memoria a breve termine in memoria a lungo termine, che richiede alta plasticità del sistema nervoso. Il giro dentato dell'ippocampo agisce come gateway principale per le informazioni in ingresso ed è anche una delle due regioni cerebrali con la neurogenesi in corso in tutta l'età adulta 1,2. Lo sviluppo della struttura dell'ippocampo si verifica durante l'embriogenesi tardiva e in particolare durante la prima 3 a 4 settimane postnatale 3. Durante lo sviluppo iniziale del giro dentato un pool di cellule staminali è istituito a richiesta per postnatale e adulta neurogenesi 4. Neuroni in via di sviluppo passano attraverso varie fasi, dalla cellule staminali attraverso diverse fasi di cellule progenitrici per la immatura e, infine, il neurone maturo durante postnatale e neurogenesi adulta. Alle diverse fasi della neurogenesi l'espressione digeni specifici è necessario per consentire la maturazione e l'integrazione dei nuovi neuroni nei circuiti dell'ippocampo 5,6.
Utilizzando genetica del topo e analisi fenotipo mediante immunoistochimica e metodi molecolari consentiti definire il pattern di espressione e la funzione di molti di questi geni. Inoltre l'analisi microarray e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) fornito informazioni sui potenziali geni bersaglio diretti e indiretti 7,8. Tuttavia, ci sono ancora molte questioni aperte riguardanti i meccanismi di regolazione dello sviluppo dell'ippocampo, in particolare lo sviluppo del giro dentato. Per ottenere una visione di come i geni specifici sono regolati è necessario un sistema che permette la manipolazione di un piccolo numero di cellule da down o up-regolazione del gene di interesse e / o dei suoi geni bersaglio e seguire il loro destino durante lo sviluppo. In utero elettroporazione di shRNAs, cDNA di geni di interesse o Cre recombinase fornisce un tale strumento. Per assicurare la presenza del DNA desiderato o piccoli RNA plasmidi di espressione dovrebbe essere utilizzato per elettroporazione. Questo approccio è implementata con successo in studio dello sviluppo corticale 9,10, ma è un approccio più impegnativo esaminando lo sviluppo del giro dentato causa della posizione delle strutture ippocampali negli strati più profondi del cervello.
Elettroporazione utero Ex seguita dalla cultura fetta organotipica è un approccio per aggirare questo problema 11,12. In contrasto in utero non elettroporazione tutta dell'embrione ma solo la testa è usato permettendo quindi di posizionare gli elettrodi in modo più favorevole per dirigere la shRNA / DNA verso l'ippocampo e giro dentato. Il nostro gruppo impiegato con successo ex utero elettroporazione per studiare il ruolo del fattore di trascrizione Bcl11b durante lo sviluppo giro dentato 8. Bcl11b ha un duplice ruolo in sviluppo giro dentato per regulating proliferazione delle cellule progenitrici nonché la differenziazione come è stato dimostrato da immunoistochimica. Per definire ulteriormente un meccanismo di coinvolgimento Bcl11b in questi processi, protocolli del gruppo Polleux 11,12 sono stati adeguati per studiare giro dentato come descritto di seguito nella sezione del protocollo. In un primo approccio alla questione è stata affrontata se Bcl11b regolamenta autonomamente cellule differenziamento delle cellule neuronali. Un secondo approccio esaminato se desmoplakin, un gene bersaglio diretto di Bcl11b, è sufficiente per salvare il fenotipo Bcl11b.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'ippocampo ha una funzione importante nell'apprendimento e nella memoria. Il giro dentato è anche una delle due regioni del cervello in cui si verifica la neurogenesi non solo durante lo sviluppo, ma anche in età adulta. Postnatale e adulti procede neurogenesi dell'ippocampo in modo simile che coinvolge molti fattori comuni. Definizione dei meccanismi regolatori di questi fattori sarà molto utile per capire le malattie neurodegenerative che a sua volta portare a nuove terapie e misure preventive. Per ott…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
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