Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
Amide waterstof / deuterium uitwisseling (ssHDX-MS) en zijketen fotolytische etikettering (SSPL-MS), gevolgd door massaspectrometrische analyse kan waardevol voor het karakteriseren van gevriesdroogde preparaten van therapeutische eiwitten zijn. Etikettering gevolgd door geschikte proteolytische vertering kan de eiwitstructuur en interacties in kaart te brengen met peptide-niveau resolutie. Aangezien het eiwit structuurelementen worden gestabiliseerd door een netwerk van chemische bindingen van de belangrijkste ketens en zijketens van aminozuren, specifieke kenmerken van atomen in de aminozuurresten geeft inzicht in de structuur en conformatie van het eiwit. In tegenstelling tot de routine-methoden die worden gebruikt om eiwitten in gevriesdroogde vaste stoffen (bijvoorbeeld, FTIR), ssHDX-MS en SSPL-MS bieden kwantitatieve en locatie-specifieke informatie te bestuderen. De omvang van deuterium opname en kinetische parameters kunnen worden gerelateerd snel en langzaam uitwisseling amide pools (N snelle N langzaam) en direct weerspiegelt het degree vouwen van eiwitten en de structuur in gevriesdroogde formuleringen. Stabiele fotolytische etikettering niet back-uitwisseling, een voordeel ten opzichte ssHDX-MS ondergaan. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor zowel ssHDX-MS en SSPL-MS, met behulp van myoglobine (Mb) als model eiwit in gevriesdroogde formuleringen die ofwel trehalose of sorbitol.
Eiwit drugs zijn de snelst groeiende sector van de biofarmaceutische industrie en bieden een veelbelovende nieuwe behandelingen voor eerder onbehandelbare ziekten, waaronder hormonale stoornissen, kanker en auto-immuunziekten 1. In 2012, de wereldwijde biotherapeutics markt bereikte $ 138.000.000.000 en zal naar verwachting $ 179.000.000.000 door het jaar te bereiken 2018 2. Eiwitten zijn groter en meer kwetsbaar dan conventionele kleine moleculen en dus meer vatbaar zijn voor vele soorten degradatie 3. Om adequate houdbaarheid en stabiliteit, zijn eiwitgeneesmiddelen vaak geformuleerd als gevriesdroogd (dwz gevriesdroogd) vaste poeders. Echter, een eiwit nog degradatie ondergaan in de vaste toestand, vooral als het natieve structuur niet behouden tijdens het lyofilisatieproces 4,5. Ervoor te zorgen dat de structuur is behouden is alleen haalbaar als er analysemethoden die eiwitconformatie kunnen peilen in de solid-state met sufficient-resolutie.
NMR spectroscopie 6 en röntgenkristallografie 7 zijn de gebruikelijke hoge resolutie methoden eiwitstructuur evalueren oplossing en kristallijne vaste stoffen 8. Vanwege de aard van hulpstoffen en verwerkingsmethoden, gelyofiliseerde eiwitformuleringen zijn meestal amorf in plaats van kristallijn 9. Het gebrek aan homogeniteit en microscopische orde maakt de hiervoor genoemde technieken onpraktisch voor eiwitten in amorfe vaste stof. Fourier transformatie infrarood spectroscopie (FTIR) 10, Raman spectroscopie 11 en nabij infrarood spectroscopie (NIR) 12 werden regelmatig door de biofarmaceutische industrie eiwit secundaire structuur vergelijken gelyofiliseerde poeders die van de natieve oplossing staat structuur. Deze werkwijzen hebben een lage resolutie en kan alleen informatie over globale veranderingen in secondaire structuur. Solid-state structurele karakterisering met behulp van FTIRheeft aangetoond ofwel zwak 13,14 of slechte 15 correlatie met langdurige opslag stabiliteit. Deze beperkingen maken de noodzaak van geschikte hoge resolutie methoden om eiwitten structurele verstoringen in de vaste toestand te identificeren.
Chemische labeling gekoppeld aan proteolyse en massaspectrometrische analyse bleek een krachtige aanpak van de monitoring eiwitstructuur en moleculaire interacties in waterige oplossing. In farmaceutische ontwikkeling heeft HDX-MS gebruikt voor epitoop kartering in antigeen-antilichaam interacties 16,17, in kaart receptor-geneesmiddel interacties 18 de effecten van post-translationele modificaties op de conformatie van eiwitgeneesmiddelen 19 monitoren en te vergelijken batch-to-batch variatie in ontwikkeling biosimilars 20. Zo hebben activeerbare liganden gebruikt om drug targets te identificeren en bindingsaffiniteit en specificiteit van geneesmiddel-receptor interacties 21,22 bepalen. Naar eXtend de toepassing van deze methoden om gevriesdroogde preparaten, heeft onze groep ontwikkelde solid-state massa waterstof deuterium uitwisseling spectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische etikettering massaspectrometrie (SSPL-MS) te eiwitconformaties en hulpstof interacties in gevriesdroogde monsters te bestuderen met een hoge resolutie.
In beide ssHDX-MS en SSPL-MS, wordt het eiwit aangeduid onder ideale reactieomstandigheden in gevriesdroogde vaste stoffen, en de monsters worden vervolgens gereconstitueerd en met massaspectrometrie met of zonder proteolytische digestie onderzocht. ssHDX-MS geeft informatie over de belangrijkste keten blootstelling aan deuterium damp, terwijl SSPL-MS geeft informatie over de omgeving van de zijketens (Figuur 1). De twee werkwijzen kunnen aldus aanvullende informaties eiwit conformatie in de vaste toestand verstrekken. Hier geven we een algemeen protocol voor het bestuderen van eiwitten in gevriesdroogde vaste stoffen middels ssHDX-MS en SSPL-MS (figuur 2), met als Mbmodeleiwit. We tonen het vermogen van de twee methoden verschillen in samenstellingen met twee verschillende excipiënten onderscheiden.
Figuur 1:. SsHDX en SSPL maatregel eiwitstructuur in gevriesdroogde vaste stoffen via verschillende markeringsmechanismen (A) In HDX, de ruggengraat amide waterstof uitwisseling met deuterium als functie van eiwitstructuur en D2O toegankelijkheid. In de vaste toestand, de snelheid en mate van deuterium uitwisseling afhangen van het niveau van D2O sorptie eiwit mobiliteit (ontvouwen en hervouwen evenementen) en de aard van de in de vaste matrix hulpstoffen. (B) In PL, UV-bestraling bij 365 nm initieert de vorming van een reactieve carbeen intermediair uit de diazirine functionele groep van pLeu en is niet-specifiek in elke XH bond (X = een ieder atoom), of ad geplaatstded over een C = C-binding in de onmiddellijke omgeving. In de vaste toestand, de snelheid en mate van labeling afhankelijk van de lokale concentratie van de labelingmiddel, bestralingstijd, eiwitstructuur en de aard van hulpstoffen aanwezig in de vaste matrix. Panelen A en B tonen de maximale theoretische etikettering die respectievelijk kunnen voordoen op backbone en zijketens in eiwit.
Figuur 2: Schematische showing solid-state HDX-MS (A) en PL-MS (B) voor eiwitten in gevriesdroogde formulering.
Verschillende studies hebben gesuggereerd dat de lokale omgeving in gevriesdroogde monsters invloed eiwitafbraak 5,29,30. De instelling van een directe relatie tussen eiwitstructuur en stabiliteit in de vaste toestand is niet mogelijk gebleken door het ontbreken van analysemethoden hoge resolutie. De toepassing van de bestaande hoge resolutie methoden, zoals HDX en PL naar gevriesdroogde poeders vereist wijziging van oplossing protocollen en zorgvuldige interpretatie van de gegevens. HDX-MS en PL-MS zijn achtereenvolgens aangenomen eiwitconformaties monitoren in de solid-state. De hier gepresenteerde resultaten en elders 27,28,31-33 hebben het vermogen van deze methoden om eiwitconformatie met hoge resolutie in de vaste omgeving te monitoren aangetoond. Hoewel de kritische stappen in de data-analyse niet verschillen van de etikettering in oplossing 34-36, zijn belangrijke overwegingen tijdens de experimentele opstelling en de interpretatie van de gegevens die nodig zijn voor solid-state Chemical etikettering.
Selectie van de etikettering reagens moet worden gebaseerd op de grootte en het mechanisme van de etikettering. De kleine omvang van deuterium laat de peptide hoofdketen gemakkelijk worden gesondeerd, terwijl de relatief grotere omvang van pLeu beperkt etikettering de zijketens. Zowel ssHDX en SSPL vertonen geen voorkeur voor een aminozuur, zodat etikettering alleen afhangt hoofdketen en zijketens blootstelling aan de matrix. Om effectief sonde eiwitconformaties in solid-state, moet de externe factoren die de etikettering proces zorgvuldig worden gecontroleerd. Het totale bedrag en de ruimtelijke verdeling van labelingmiddel in gevriesdroogde vaste verschilt van waterige oplossingen.
In ssHDX, kan de hoeveelheid D 2 O in de vaste matrix het percentage eiwitontvouwende (of gedeeltelijke ontvouwing), hervouwen en deuterium uitwisseling beïnvloeden. Dit is niet het geval met de oplossing HDX, waarbij het eiwit monster wordt gewoonlijk verdund met een ruime hoeveelheid D 2 O.Zorgvuldige screening van de effecten van de hydratatie van de ssHDX tarief kan de keuze van de ideale RH voorwaarden te informeren. Om de snelheid van vocht sorptie controleren en ineenstorting van het poeder in formuleringen die hygroscopisch hulpstoffen (bv sucrose en trehalose) te vermijden, ssHDX kan worden uitgevoerd onder gekoelde omstandigheden (2-8 ° C). Onze vorige studie over hydratatie effecten toonde verhoogde snelheid en mate van uitwisseling met toename van het vochtgehalte, zoals verwacht. In veel van ons werk, een tussenproduct RV van 43% bij 5 ° C gebleken ideale formuleringen onderscheiden redelijke tijd 24 te zijn. De reactie wordt gewoonlijk uitgevoerd totdat een plateau bereikt. Dit zorgt ervoor dat vocht sorptie en diffusie in de vaste stof niet de HDX te regelen. Het gebruik van kleine vaste steekproefomvang met pre-vriesdrogen volume van ≤2 ml helpt ook om ervoor te zorgen dat D 2 O dampsorptie is nagenoeg voltooid in het begin van de periode uitwisseling. Hoewel ssHDX-MS biedtkwantitatieve informatie over de conformatie van het eiwit in vaste toestand, zijn er bepaalde omstandigheden waarin interpretatie van gegevens niet volledig kan worden gebaseerd op de ssHDX studie alleen. Het is mogelijk dat de verlaagde deuterium opname waargenomen in een monster (in vergelijking met controle) kan door de hogere retentie van eiwitstructuur of de aanzienlijke hoeveelheid eiwit aggregaten aanwezig in het monster. In een dergelijk geval, de interpretatie van ssHDX gegevens vereist resultaten van andere complementaire methoden. Piekverbreding in deuterium massaspectra werd waargenomen voor verscheidene Mb formuleringen 27,28. Dit kan te wijten zijn aan verschillende factoren, zoals de aanwezigheid van gedeeltelijk ontvouwen eiwitpopulatie ruimtelijke heterogeniteit in het monster of de ruimtelijke gradiënten in de D2O concentratie. Echter, deze factoren niet onderscheiden in ssHDX-MS en vraagt verder onderzoek.
Zoals SSPL-MS is relatief nieuw in vergelijking met andere methoden, continu leren abuit haar toepassingen en beperkingen nodig is. In SSPL, wordt de foto-cross-linker gevriesdroogd met het eiwit. Het gebrek aan vocht beperkt de mobiliteit van componenten binnen de vaste matrix en de partiële structurele ontspanning die kunnen optreden bij vochtabsorptie in ssHDX geen verschijnsel SSPL. Dit beperkt etikettering SSPL de onmiddellijke nabijheid van de foto-vernetter. In tegenstelling HDX-MS, MS / MS analyse van de covalent gelabeld eiwit residuen niveau structurele informatie. Aangezien SSPL etikettering covalent en irreversibel, rug uitwisseling niet plaatsvindt en monsters kunnen worden bereid en zonder zorg voor verlies van label geanalyseerd. Om diffusie van labelingmiddel vergemakkelijken en labelingsefficiëntie in vaste matrix kan SSPL worden uitgevoerd met toenemende% RH. pLeu opname kan ook worden verbeterd door verhoging van de concentratie van fotoreactieve middel. De molaire verhouding van eiwit pLeu kan naar wens worden gevarieerd. In het algemeen 100x molaire overmaat pLeu proTein zal zorgen voor een adequate etikettering. Echter kunnen hoge pLeu concentratie de eiwitverlies tertiaire structuur in de vaste matrix. Vandaar Naast etikettering kinetiek en formulering samenstelling winkelwagentje pLeu concentratie moet worden gebaseerd op het behoud proteïne structurele integriteit. Zoals pLeu nonselectively etiketten XH (waarbij X = C, N, O) groep, is het mogelijk dat hulpstoffen met gelijkaardige etikettering sites kunnen grote invloed hebben op het niveau van eiwit etikettering. De interferentie van hulpstoffen in de beschikbaarheid van pLeu voor eiwitmarkerend nog te karakteriseren. Het is bekend dat het carbeen gegenereerd diazirine activering niet residu specifiek, maar een studie rapporteert voorkeur voor Asp en Glu 36. Hoewel het goed te weten ongeveer rest-specifieke interacties, peptide-niveau-informatie is ook nuttig en kunnen worden gebruikt om hulpstoffen ontwerpen om gebieden te blokkeren met hoge matrix blootstelling in de vaste toestand. SSPL-MS geeft gedetailleerde kwalitatieve informatie echterkwantitatieve gegevens moeten worden verkregen en robuuste metrics moeten worden ontwikkeld voor de formulering van de verschillen in een verscheidenheid van gevriesdroogde systemen te analyseren.
Het gebruik van een residu-specifiek label gecombineerd met MS / MS analyse verder versterken oplossing van het amino- zuurniveau. Labeling reagentia zoals 2,3- butaandion labelen Arg, N-hydroxysuccinimide derivaten Lys en N -alkylmaleimide derivaten Cys kunnen worden gebruikt om moleculaire interacties in gevriesdroogde poeder nauwkeurig in kaart. Maar deze reagentia pH-afhankelijk en de reacties niet zo goed beheerd zoals fotolithische labeling in vaste toestand. Een alternatieve benadering is om de foto-vernetter nemen in de eiwitsequentie met gebruik van auxotrofe cellijnen, plaatsgerichte mutagenese of zijketen derivatisering.
Onze vorige ssHDX-MS en SSPL-MS studies hebben aangetoond dat de etikettering van eiwit afhankelijk van de aard en de hoeveelheid hulpstoffengebruikt 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS van Mb mede-gevriesdroogd met guanidinehydrochloride (Gdn.HCl) toonden meer deuterium opname dan Mb mede-gevriesdroogd met een laag moleculair gewicht suikers 32. In een aparte SSPL-MS studie, Mb mede-gevriesdroogd met Gdn.HCl toonde een betere bescherming tegen fotolytische etikettering dan Mb met sucrose 33. Verder kwantitatieve metingen van ssHDX-MS zijn sterk gecorreleerd met de stabiliteit van eiwitten tijdens langdurige opslag 28. Deze studies suggereren dat ssHDX of SSPL eiwit weerspiegelt de mate van structurele retentie van de proteïne in gevriesdroogde poeder. Wij zijn van mening dat het behoud van de secundaire structuur in gevriesdroogde poeders biedt gunstige omgeving voor de zijketen etikettering met pLeu en bescherming van de amide waterstof uit deuterium uitwisseling. Echter, gedetailleerde vergelijking van de informatieve inhoud van deze methoden moet in de toekomst te worden uitgevoerd. Hoewel tot vaststelling van het nut van ssHDX-MS en SSPL-MSals een formulering screeningsmethode uiteindelijk zal verlangen dat die wordt toegepast op vele eiwitten, de resultaten van onze recente studies ondersteunt haar bredere toepassing. Met de verdere ontwikkeling, worden deze methoden naar verwachting op grote schaal bruikbaar voor het karakteriseren van solid-state eiwitformuleringen in de biofarmaceutische industrie.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |