Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
酰胺氢/氘交换(ssHDX-MS)和侧链光解标记(SSPL-MS),接着质谱分析可用于表征蛋白质治疗剂的冻干制剂有价值。标记后跟适当的蛋白水解消化允许蛋白质结构和相互作用被映射用肽级分辨率。因为蛋白质的结构元件由化学键从主链和侧链的氨基酸,原子的氨基酸残基的特定的标签提供洞察蛋白质的结构和构象的网络稳定化。与此相反,以用于研究在冷冻干燥的固体( 例如 ,FTIR),ssHDX-MS和SSPL-MS提供定量和特定于站点的信息的蛋白质的常规方法。氘掺入和动力学参数的程度可以与快速和缓慢交换酰胺池(N 高速 ,N- 慢 ),并直接反映度稀土元素蛋白质折叠和结构在冻干制剂的。稳定光解标签不经历回交换,过ssHDX-MS的优点。这里,我们提供了两种ssHDX-MS和SSPL-MS的详细方案,使用肌红蛋白(MB),为在含有任一海藻糖或山梨糖醇的冻干制剂模型蛋白。
蛋白质类药物是生物制药行业中增长最快的行业,并提供了以前难治性疾病,包括荷尔蒙失调,癌症和自身免疫性疾病1有前途的新的治疗方法。在2012年,全球生物治疗市场达138十亿,预计将达到179十亿由2018年2。蛋白质是更大,比传统的小分子药物比较脆弱,因此更容易受到多种类型降解3。以确保足够的贮存寿命和稳定性,蛋白质药物通常配制为冻干( 即冷冻干燥)固体粉末。然而,蛋白质可能仍然经历降解,在固体状态下,特别是如果冻干过程4,5中,不保留其天然结构。确保该结构被保持是可行的只有,如果有,可在固态与sufficien探测蛋白质构象的分析方法吨分辨率。
核磁共振光谱6和X射线晶体7顷常用高分辨率方法在溶液和结晶固体8评估蛋白质结构。因为赋形剂和所用的加工方法的性质,冻干蛋白质制剂通常非晶态而不是晶态9。均匀性和微观顺序的缺乏使得上述技术不切实际的无定形固体的蛋白质。傅里叶变换红外光谱(FTIR)10,拉曼光谱11和近红外光谱(NIR)12已被经常使用的生物制药行业到蛋白质二级结构在冻干粉末比较于天然溶液态的结构。然而,这些方法是低的分辨率,并且可以仅提供关于二级结构的全球变化的信息。采用FTIR固态结构表征已经表明要么弱13,14或差的15的相关性的长期贮存稳定性。这些局限性强调需要合适的高分辨率的方法来识别在所述固态蛋白质结构扰动。
再加上蛋白水解和质谱分析化学标记已成为一个强大的方法,以在水溶液中监测蛋白质结构和分子间的相互作用。在药物开发,HDX-MS已经被用于表位作图在抗原-抗体相互作用16,17,映射受体药物相互作用18,并监控对蛋白质药物19的构象的翻译后修饰的影响,并比较批与批变异在显影生物仿制药20。同样,可光活化的配体已用于鉴定药物靶标,并确定结合亲和力和药物-受体相互作用21,22特异性。到eXTEND这些方法对冻干制剂中的应用,我们小组已经开发固态氢氘交换质谱(ssHDX-MS)和固态光解贴标质谱(SSPL-MS),以研究蛋白质的构象和相互作用的赋形剂的冻干样品中具有高的分辨率。
在这两种ssHDX-MS和SSPL-MS蛋白质理想的反应条件以冻干的固体下标,并且然后将样品复溶,并用质谱法具有或不具有蛋白水解消化进行分析。 ssHDX-MS提供了关于主链暴露在氘气的信息,而SSPL-MS提供( 图1)上的侧链的环境的信息。这两种方法从而可以提供关于蛋白的构象中的固体状态的补充信息。在这里,我们提供了一个一般协议,用于学习在使用ssHDX-MS和SSPL-MS的冻干的固体蛋白质( 图2),用Mb的作为模型蛋白。我们表明这两种方法的区别与两个不同的赋形剂的制剂的差异的能力。
图1:ssHDX和SSPL测量蛋白质结构中,通过不同的标记机制冻干的固体(A)的在HDX,骨干酰胺氢作为蛋白质结构的函数,并且D 2 O中可用的与氘交换。在固态,速率和氘交换的程度取决于D 2 O中的吸附,蛋白质迁移率(解折叠和重折叠事件)和存在于固体基质中的赋形剂的性质的水平。 (b)在PL,紫外线照射在365nm下发起的形成的反应性卡宾从pLeu的diazirine官能团中间体和插入非特异性成任何XH键(X =任何原子),或广告跨C = C键在其附近进行引导。在固态,速率和标签的程度上取决于标记试剂的局部浓度,照射时间,蛋白质结构和存在于固体基质的赋形剂的性质。图A和B显示了可在蛋白质分别发生在主链和侧链的最大理论标签。
图2:示意图,显示固态HDX-MS(A)和PL-MS(B)的蛋白冻干制剂。
一些研究表明,在局部环境冻干样品中影响蛋白质降解5,29,30。但是,建立在固态蛋白质结构和稳定性之间的直接关系一直没有可行由于缺乏高分辨率分析方法。现有的高分辨率的方法,如HDX和PL以冻干粉的应用程序需要的解决方案,细致的数据解释的修改。 HDX-MS和PL-MS相继通过监测蛋白质构象中的固体状态。结果这里提出和其他地方27,28,31-33已经证明这些方法来监测蛋白质构象具有高分辨率的固体环境的能力。虽然在数据分析中的关键步骤不从标记变化在溶液34-36,实验装置和数据解释期间重要的考虑所需的固态CHEMICAL标志。
选择标记试剂必须基于大小和标签的机制。氘的小尺寸允许肽骨架能够容易地探测,而pLeu的相对较大尺寸限制了标签的侧链。既ssHDX和SSPL显示没有偏爱的任何氨基酸,以便标签仅取决于主链和侧链暴露于基质。以有效地探测蛋白质的构象中的固态,影响了标号处理的外部因素,必须仔细控制。总量和标记试剂的冻干固体的空间分布是从水溶液中不同。
在ssHDX,D 2 O中,在固体基质的量可以影响蛋白质的折叠的速率(或部分解折叠),重折叠和氘交换。这是不与溶液的HDX,其中蛋白质样品通常与D 2 O的充足体积稀释的情况下水化对ssHDX率的影响,认真筛选可以告知理想的RH条件的选择。以控制水分吸附的速率和避免粉末在含有吸湿的赋形剂( 例如蔗糖和海藻糖)的制剂塌陷,ssHDX可能在冷藏条件下进行(2-8℃)。我们对水化作用先前的研究显示增加汇率和程度与水分含量增加,符合市场预期。在多我们的工作中,有43%的中间RH下在5℃下的已被证明是理想的,以区分制剂在合理的时间24。该反应通常进行至达到平稳状态。这可确保水分的吸附和扩散到固体不控制在HDX速率。使用小型固体样品的尺寸与≤2毫升预冻干量也有助于确保使D 2 O蒸汽吸附基本完成,在交流期间的早期。虽然ssHDX-MS提供蛋白质在固态的构象的定量信息,在有些情况下数据的解释不能完全基于ssHDX研究单独一定的条件。这可能是一个样品(当与对照相比)中,由于较高的保留的蛋白质结构或显著量蛋白质聚集物存在于样品中的表达减少氘摄取观察到的可能。在这种情况下,ssHDX数据解释需要来自其他互补的方法的结果。在氘化质谱峰宽观察到几MB配方27,28。这可能是由于多种因素,例如部分地折叠蛋白人口,空间异质性的样品中存在,或者在D 2 O中的浓度的空间梯度。但是,这些因素并没有区分在ssHDX-MS,需要进一步调查。
由于SSPL-MS是比较新的,相比其他方法,不断学习AB其应用和限制是必需的。在SSPL,光交叉连接体被冻干的蛋白质。湿气的缺乏限制了组分的流动性的固体基质中,并与在ssHDX水分吸附可能发生的局部结构弛豫现象并非在SSPL。这在SSPL限制标记到光交叉连接体的附近。然而,与HDX-MS的共价标记的蛋白质可提供残级的结构信息的MS / MS分析。由于SSPL标记是共价,不可逆的,背交换不会发生,并且可将样品制备并无需关心标签的损失进行分析。为了方便标记剂的扩散,并提高在固体基质标记效率,SSPL可以与增加%RH下进行。 pLeu摄取,也可以通过增加光反应剂的浓度提高。蛋白与pLeu的摩尔比可以根据需要变化。在一般情况下,一个100倍摩尔过量pLeu的亲蛋白会确保有足够的标签。然而,高pLeu浓度可能导致蛋白质三级结构中的固体基质的损失。因此,除了标识动力学和制剂的组合物,选择pLeu浓度也必须基于维持蛋白质的结构完整性。作为非选择性pLeu标签XH(其中X = C,N,O)基团,它是可能的赋形剂具有类似标记位点能极大地影响蛋白质标记的水平。在pLeu用于蛋白质标记的可用性赋形剂的干扰仍未被表征。已知的是从diazirine活化产生的卡宾不残留特异性,但是一项研究报告偏向天冬氨酸和谷氨酸36。虽然这是很好的了解残余特异性相互作用,肽级信息,也是有用的,并且可以用来设计赋形剂阻断区域与在固体状态下具有高基质曝光。然而,SSPL-MS提供了详细的定性信息,定量数据需要获得和健壮的指标需要开发以分析在各种冷冻干燥系统的制剂的差异。
使用结合MS / MS分析残余物特异性标签可以进一步增强的分辨率的氨基酸的水平。标记试剂如2,3-丁二酮标记精氨酸,对于半胱氨酸赖氨酸和 N -alkylmaleimide衍生物N-羟基衍生物可以用来精确地映射在冻干粉末分子间的相互作用。然而,这些试剂是pH依赖性和反应可能不如良好控制作为固态光解标识。另一种方法是将光致交联剂与使用营养缺陷型细胞系中,位点定向诱变或侧链衍生的蛋白质序列。
我们以前ssHDX-MS和SSPL-MS研究表明蛋白的标记取决于赋形剂的性质和量使用24,27,28,31-33,37,38。兆的ssHDX-MS的共同冻 干用盐酸胍(Gdn.HCl)表现出更大的氘摄取比Mb的共同冻 干的低分子量糖32。在一个单独的SSPL-MS的研究,MB共同冻 干与Gdn.HCl显示,从比兆光解的标签更好的保护与蔗糖33。另外,从ssHDX-MS定量测量已经高度在长期贮存28相关蛋白质的稳定性。这些研究表明,ssHDX蛋白或SSPL反映在冻干粉末中的蛋白质的结构保持的程度。我们认为,二级结构在冻干粉末的保留提供侧链标记与pLeu和从氘交换保护酰胺氢的有利环境。然而,需要来自这些方法的信息内容的详细的比较将在未来进行。虽然建立ssHDX-MS和SSPL-MS的效用作为制剂的筛选工具最终将需要它适用于许多蛋白质,从我们最近的研究结果支持其更广泛地采用。随着进一步的发展,这些方法预期可用于在生物制药行业表征固态蛋白质制剂广泛有用的。
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |