العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
فقدان الخلايا العصبية الدوبامين من المادة السوداء بارس المكتنزة يؤدي إلى أعراض الكاردينال السيارات من مرض باركنسون (PD)، والثاني اضطراب الاعصاب الأكثر انتشارا. السبب الكامن وراء زوال هذه الفئة من السكان الخلايا العصبية الدماغي المتوسط غير معروف. لدراسة المسارات البيوكيميائية المسؤولة عن تطوير وتحوير الخصائص الفسيولوجية العصبية وبقاء الخلايا العصبية mesDA، عدة زراعة الخلايا والنظم نموذج حيواني استخدمت. خطوط الخلايا خلده، بما في ذلك الدوبامين الفئران خط الخلية 1RB 3 AN 27 (N27)، والدوبامين البشري خط الخلية العصبية SH-SY5Y، الماوس الدوبامين خط الخلية المختلطة MN9D والدماغ المتوسط البشري LUHMES خلايا استخدمت لدراسات الآلية البيوكيميائية ومحدودة 1 -5. لدراسة فقدان محددة من الخلايا العصبية mesDA، والعديد عصبي القائم وتم تطوير نماذج وراثية 6-8. ثقافات الدماغ المتوسط البطنية الأولية، وتوفير أداة لا غنى عنها لدراسة خصائص الخلايا العصبية ومتشابك من الخلايا العصبية الدوبامين ومسارات المتورطين في التسبب في هذا الاضطراب شائع.
هنا نقدم بروتوكول مفصلة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، والذي يحتوي على تعديلات مما أدى إلى ارتفاع البقاء على قيد الحياة وزيادة العائد من coverslips في الجنين. استخدام ما قبل ناضجة الدماغ المتوسط E12.5 الماوس (E14.5 في الفئران) يعزز البقاء على قيد الحياة. والخلايا العصبية في هذه السن لم تتطور محاور عصبية بعد، الأمر الذي يترك خلايا سليمة أثناء تشريح ويقلل من الإجهاد وبالتالي زيادة كبيرة في قدرتها على البقاء. وبالإضافة إلى ذلك، تشريح دقيق من المخ الأوسط بطني، كما هو موضح في المادة 2 من هذا البروتوكول، وكذلك تعزز البقاء على قيد الحياة. لزيادة أعداد coverslips في الجنين، ويقدم طريقة الطلاء بديل في المادة 4 من هذا البروتوكول. وهذا يؤدي إلى إنتاجية تصل إلى 10 coverslips في الجنين بالمقارنة مع 4 coverslips تحتوبالتالي الظروف الطلاء القياسية تقليل كمية من الحيوانات في التجربة.
الخلايا العصبية في الثقافة المعرض ثمرة من المحاور وdentrites، تشكيل اتصالات متشابك وتكشف عن وجود علامات العصبية ومتشابك مما يجعل هذه الثقافات مناسبة لتصوير الخلايا الحية، immunocytochemical والدراسات الكهربية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الثقافات العصبية يسهل التلاعب الجيني والصيدلانية. ثمرة neurites التي من يوم 2 في المختبر تتيح للدراسات التنموية. وعلاوة على ذلك، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل الثقافات (تصل إلى ستة أسابيع) يجعلها مناسبة لدراسة بطيئة، وانحطاط التدريجي لهذه الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا العصبية الدوبامين في المخ الأوسط هي المصدر الرئيسي الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي. وهي تنقسم إلى ثلاث مجموعات، بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc)، المنطقة البطنية السقيفية (VTA) والميدان retrorubral (قوة الرد السريع) 10، 11. الخلايا العصبية في SNpc وVTA تؤدي إلى ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
