Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
Verlies van dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta leidt naar de kardinale motorische symptomen van de ziekte van Parkinson (PD), de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte. De onderliggende oorzaak van de ondergang van deze mesencefale neuronale populatie is niet bekend. Om de biochemische routes die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en neurofysiologische modulerende eigenschappen en overleving van neuronen mesDA verschillende celkweek en diermodellen zijn gebruikt bestuderen. Onsterfelijk gemaakte cellijnen, zoals de rat dopaminerge cellijn 1RB 3 AN 27 (N27), menselijke dopaminerge neuroblastoom cellijn SH-SY5Y, de muis dopaminerge hybride cellijn MN9D en menselijke mesencefale LUHMES cellen zijn gebruikt voor biochemische en beperkte mechanistische studies 1 -5. Voor de studie van het specifieke verlies van mesDA neuronen, verschillende neurotoxine gebaseerd en genetische modellen ontwikkeld 08/06. Primaire ventrale middenhersenen culturen, Bieden een onmisbaar instrument voor het bestuderen van de neuronale en synaptische eigenschappen van de dopaminerge neuronen en het betrokken zijn bij de pathogenese van deze veel voorkomende aandoening paden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van mesencefale dopaminerge neuronen, die modificaties resulteert in hogere overlevingskansen en verhoogde opbrengst van dekglaasjes per embryo bevat. Het gebruik van pre-mature E12.5 muis mesencephalon (E14.5 in rat) verhoogt de overlevingskansen. Op deze leeftijd neuronen zijn nog niet axonen ontwikkeld, welke cellen intact laat tijdens dissectie en minimaliseert de stress waardoor aanzienlijke verhoging van levensvatbaarheid. Daarnaast zorgvuldige dissectie van de ventrale middenhersenen, zoals beschreven in paragraaf 2 van dit protocol, een verdere versterking van de overlevingskansen. Om de nummers van dekglaasjes per embryo te verhogen, wordt een alternatieve plating methode gepresenteerd in hoofdstuk 4 van dit protocol. Dit leidt tot een opbrengst van 10 dekglaasjes per embryo vergeleken met 4 dekglaasjes onderstandaard plating worden dus het aantal dieren per experiment verminderen.
Neuronen in cultuur tentoonstelling uitgroei van axonen en dentrites, vormen synaptische verbindingen en onthullen de aanwezigheid van neuronale en synaptische markers maken van deze culturen geschikt voor live cell imaging, immunocytochemische en elektrofysiologische studies. Bovendien is het gebruik van neuronale kweken vergemakkelijkt genetische en farmacologische manipulatie. Uitgroei van neurieten van dag 2 in vitro zorgt voor ontwikkelingsstudies. Bovendien is de lange termijn overleving van culturen (maximaal zes weken) maakt ze geschikt voor onderzoek van de langzame, progressieve degeneratie van deze neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopaminerge neuronen in de middenhersenen is de belangrijkste bron van dopamine in het centrale zenuwstelsel. Zij zijn verdeeld in drie groepen, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventrale tegmental gebied (VTA) en retrorubral veld (RRF) 10, 11. De neuronen in SNpc en VTA aanleiding geven tot belangrijke dopaminerge paden, mesocorticale, mesolimbic en Nigro-striatum, die betrokken zijn bij functies zoals de controle van de emotie, motivatie en motorische gedrag. Verdwijnen van neuronen in SNpc en function…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
