Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
O sulfato de dextrano (DS) e quitosana (CS) são polissacarídeos com múltiplas substituídos grupos sulfato carregados negativamente (em DS), ou grupos amina carregados positivamente (desacetilados CS). Quando misturado numa solução aquosa, os dois polissacáridos formar complexos de polielectrólitos através de interacções electrostáticas. Os complexos resultantes podem formar grandes agregados que irá ser progressivamente-separado da solução aquosa (ou precipitados), pequenas partículas que são dispersíveis em água (colóides). As condições específicas que contribuem para esses resultados têm sido extensivamente estudada, e foram resumidos e ilustrado em pormenor numa publicação recente 1. Entre essas condições, dois requisitos básicos para a produção de partículas dispersíveis em água são os polímeros de carga oposta deve 1) têm massa molar significativamente diferente; e 2) ser misturado numa relação não estequiométrica. Estas condições permitirão que os segmentos poliméricos complexados carga neutra gerados pela carganeutralização para segregar e formar o núcleo da partícula, e o excesso de polímero para formar o invólucro exterior 1. As partículas de glicanos descritos neste protocolo são destinados para a administração pulmonar, e são projetados para serem net carregado negativamente, e de dimensões nanométricas. A carga de superfície negativa reduz a probabilidade de absorção celular das partículas de 2,3. Partículas de dimensão nanométrica facilitar a passagem através das vias aéreas distais. Para atingir este objectivo, a quantidade de DS utilizado nesta preparação é em excesso de CS (proporção em peso de 3: 1); e alta massa molecular DS (peso-médio MW 500.000) e de baixo peso molecular, CS (MW gama 50-190 kDa, 75-85% desacetilada) são usadas.
SDF-1α é um factor homing células estaminais, que exerce a função de homing através da sua actividade quimiotáctica. SDF-1α desempenha um papel importante no retorno e manutenção de células estaminais hematopoiéticas na medula óssea e no recrutamento de ProgeNitor células no tecido periférico para a reparação de lesão 4,5. SDF-1α tem um local de ligação à heparina na sequência da proteína, o que permite que a proteína se liga à heparina / sulfato de heparano, formam dímeros, ser protegido contra a protease (CD26 / DPPIV) inactivação, e interagem com células alvo através dos receptores de superfície celular 6-8. DS tem propriedades estruturais semelhantes às da heparina / sulfato de heparano; assim, a ligação de SDF-1α para DS seria semelhante à dos seus ligantes poliméricos naturais.
No protocolo seguinte, descreve-se a preparação de nanopartículas de SDF-1α-DS-CS. Os procedimentos representam uma das formulações que foram previamente estudadas 9. O protocolo é originalmente adaptado de uma investigação do VEGF-DS-CS nanopartículas 10. Uma preparação em pequena escala é descrito, o qual pode ser facilmente dimensionado para cima com as mesmas soluções de reserva e as condições de preparação. Após a preparação, as partículas são caracterizadas by examinar seu tamanho, potencial zeta, a extensão da incorporação SDF-1α, in vitro tempo de liberação e atividade do incorporada SDF-1α.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como mencionado acima, as nanopartículas DS-CS são formados através de neutralização de cargas entre polianião (DS) e policatião (CS) moléculas. Uma vez que a interacção de cargas ocorre prontamente durante a colisão molecular, a concentração das soluções de polímero e a velocidade de agitação durante a mistura é crítica para o tamanho das partículas resultantes. A tendência geral é que DS e CS 15 soluções e maior resultado velocidade de agitação em partículas menores mais diluído…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenções: HL671795, HL048743 e HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
