Подготовка и характеристика SDF-1α-хитозан-Декстрансульфат наночастиц
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
Декстрансульфат (DS) и хитозан (CS) являются полисахариды с несколькими замещенных отрицательно заряженных групп сульфат (в DS), или положительно заряженные аминогруппы (деацетилируется CS). При смешивании в водном растворе, два полисахариды образуют полиэлектролитных комплексов путем электростатических взаимодействий. Полученные комплексы могут образовывать крупные агрегаты, которые будут фазовое разделение из водного раствора (выделений), или мелкие частицы, которые диспергируемые в воде (коллоиды). Конкретные условия, которые способствуют этих результатов были тщательно изучены, и были обобщены и подробно показано на недавнем обзоре 1. Среди этих условий, два основных требования для получения диспергируемые в воде частицы являются противоположно заряженные полимеры должны 1) имеют существенно различные молекулярную массу; и 2) можно смешивать в не-стехиометрическом соотношении. Эти условия позволят заряд, нейтральный образующего комплекса полимерных сегментов, генерируемых бесплатноНейтрализация отделить и образуют ядро частицы, а избыток полимера с образованием внешнюю оболочку 1. Гликан частицы, описанные в этом протоколе предназначены для доставки в легкие, и предназначены для чистой заряжены отрицательно, и нанометровых размеров. Отрицательный поверхностный заряд снижает вероятность клеточного захвата частиц 2,3. Частицы размерности нанометров облегчения прохождения через дистальных дыхательных путях. Для достижения этой цели, количество DS, используемый в этом препарате превышает CS (массовое соотношение 3: 1); и высокой молекулярной массой DS (средневзвешенный МВт 500000) и низкой молекулярной массой CS (диапазон MW 50-190 кДа, 75-85% деацетилированный) используются.
SDF-1α является фактором самонаведения стволовых клеток, который оказывает функцию самонаведения через его активности хемотаксиса. SDF-1α играет важную роль в самонаведения и обеспечения гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, и найма PROGEnitor клетки к периферической ткани для ремонта травма 4,5. SDF-1α имеет сайт гепарин-связывающей в его последовательности белка, что позволяет белок связывается с гепарином / гепарансульфата, образуют димеры, быть защищены от протеазы (CD26 / DPPIV) инактивации и взаимодействуют с клетками-мишенями через рецепторы клеточной поверхности 6-8. DS имеет аналогичные структурные свойства, как гепарин / гепарансульфата; Таким образом, связывание SDF-1α в DS будет похож на своих природных полимерных лигандов.
В следующем протоколе мы описываем получения наночастиц SDF-1α-DS-CS. Процедуры представляют собой один из составов, которые были ранее изученных 9. Протокол изначально приспособлены из исследования VEGF-DS-CS наночастиц 10. Небольшой подготовки масштаб описано, которые могут быть легко расширены с тех же исходных растворов и условий приготовления. После подготовки, частицы характеризуются бу исследуя их размер, дзета-потенциал, степень SDF-1α регистрации, в пробирке время выпуска и деятельность объединенной SDF-1α.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как упоминалось выше, наночастицы DS-CS сформированы с помощью нейтрализации заряда между полианиона (DS) и поликатиона (CS) молекул. Поскольку взаимодействие заряда происходит легко при молекулярном столкновения, концентрация полимерных растворов и перемешивание скорости во время смеши…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH гранты: HL671795, HL048743 и HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
