アン<em>エクスビボ</em>レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

軸索の変性は神経外傷、脳卒中、自己免疫、および神経変性疾患を含むいくつかの神経学的状態にまたがる罹患率の顕著な原因である。末梢神経系（PNS）、中枢神経系とは異なり（CNS）の軸索は、一度による内因性および外因性障壁（ すなわち、ミエリン変性時の瘢痕形成の間に生成され、遊離した軸索成長の阻害分子^）1の両方に負傷再生する限られた能力を有している^-7。これらの障害のいくつかは、広く調査されてきたが、CNS軸索変性を防ぐ頑強な軸索再生を促進し、機能的な連結的に復元することを目的とした治療的介入は、限定されるもので残る。

一度彼らの相馬から分離軸索は軸索腫脹、回転楕円体の形成及び^（8にレビュー）最終的な断片化することを特徴とするウォーラー変性として知られている変性のステレオタイプのプロセスを経る。で対照的に、離断周辺軸索の細胞体との連続性に残る近切り株は、その端部に腫脹を形成し、バックランヴィエの最も近いノードに死亡した後、その後の軸索再生のために必要な成長円錐の形成、重要な前提条件を開始することができます^9-11。対照的に、多くの中央軸索の軸索近位末端は、特徴的な「endbulbs」または後退電球を形成成長円錐を形成し、その代わりに離れて、それらが損傷した後に^12〜15ヶ月のままで、損傷部位から後退させることができない。主要な軸索損傷に加えて、追加の軸索損傷/損失も大幅に最初の損傷から免れた軸索に発生する可能性があります。最初は免れる軸索のこの遅延軸索損失は、二次的軸索変性と呼ばれている。傷害にCNSの軸索のこの固有の応答は、機能的な軸索再生の脳や脊髄に達成するために、さらに困難な目標をレンダリングします。

haであるが軸索損傷（ 例えば、回転楕円体の形成、後退電球）のllmarksがよく、死後組織と軸索変性の実験モデルから特徴づけられている、これらの動的プロセスの根底にある分子メカニズムの解明が制限されています。これらの研究のほとんどは、本質的に時間をかけて、個々の軸索の応答を捕捉するために失敗した静的なエンドポイントでの観察に依存していた。しかし、外因的に軸索トレーサーは静的セクションから、ライブイメージング中の軸索の応答を解明する有用であった適用、遺伝的にコードされた軸索マーカーの可用性が大幅に蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで軸索を可視化する当社の能力を向上させた。実際、ケルシェンシュタイナーや同僚からの精液報告書は、第一脊髄の背側の列に自分の予想を送るニューロンのサブセットで緑色蛍光タンパク質をコードしてはThy1 -GFP-Sのマウスを用いたin vivoでの軸索変性と再生の直接的な証拠を提供したコード^16。ライブイメージングは、2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）を使用して接近し、関心のある細胞の遺伝的蛍光タンパク質標識は、軸索変性のような多くの多様な動的プロセスへの直接的な証拠と機構的洞察を提供し続けたCa ²⁺シグナル伝達、軸索再生、星状細胞生理学、ミクログリア生理学、傷害^17-25への応答。

軸索とは対照的に、ほとんどリアルタイムで負傷ミエリン反応知られている。ミエリンは、PNSにおけるCNSおよびシュワン細胞におけるオリゴデンドロサイトによって生成され、維持白質の重要なコンポーネントです。ミエリンは、軸索の表面の99％を絶縁し、そうすることによって、最近Buttermore らによる審査、迅速かつ効率的な跳躍インパルス伝播をサポートする高抵抗、低容量保護カバーを提供しています^。26。傷害に対するミエリンの動的応答をキャプチャするために、我々はソルバ、親油性を使う蛍光染料ナイルレッド^27。この生体染色のソルバトクロミック特性は、物理化学的環境^28,29に依存し、その発光スペクトルのスペクトルシフトを可能にする。これらの特性は、axomyelinic損傷のメカニズムへの洞察を得るために有用であり、適宜選択ダイクロイックおよび発光フィルターを用いて可視化またはスペクトル顕微鏡^27を使用して解決することができる。例えば、ナイルレッドの発光スペクトルは、ブルーシフトなどの脂肪細胞と正常なCNSミエリン（発光ピーク〜580から590 nm）の²⁷に見られるような極性の低い、脂質の豊富な環境である。対照的に、〜625nmの軸索として形成endbulbsであるこの生体染色色素の発光スペクトルのピークは、軸索立ち枯れ^27を受ける。通常のミエリンに対するendbulbsで特異的にこれらのスペクトルシフトの基礎となる正確なメカニズムは不明であるが、このようなスペクトルの変化は、タンパク質の蓄積や組織崩壊につながる基礎となる変化を明らかにすることができる疎水性結合部位²⁷の露出。

in vivoイメージングは、それらのネイティブ環境で脊髄軸索損傷のダイナミクスを観察するための究極の測定基準であるが、それは技術的に困難であり、かなりの外科専門知識を必要とし、多くの場合、実験の成果物（ 例えば、炎症や傷跡を導入することが脊柱を露出するために手術を繰り返す形成）。また、高価な機器は、多くの場合、顕微鏡対物レンズ下で無傷動物の懸濁液及び位置決めを可能にするために必要とされる。動物は慎重に、彼らは、流体が補充されることを確認するために、そして長引く麻酔をイメージングセッションに低酸素症の兆候がないことを確認するために、温かいまま確保するためにも監視する必要がある。軸索とミエリンは絶対生存したまま一定灌流および適切な酸素レベルを必要とする後者は非常に重要である。しかし、これは、しばしばin vivo研究ほとんどの報告または監視されていない日付。による心拍数及び（イソフルラン麻酔成体マウスの呼吸に加えて、動きアーチファクト：〜毎分300〜450ビート（BPM）は、97から98パーセントの酸素飽和度（通常レート〜632 BPM）および〜55-65呼吸を維持するために最適であるでも最速のレーザースキャンが避けられないこれらの動きを受けますように、生体内の脊髄イメージング中に発生した））は、それぞれ、（通常のレートは毎分〜163呼吸である）毎分^30は、挑戦的な高解像度の蛍光顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化するアーティファクト。移植可能な剛性椎フレームウィンドウと組み合わせる超共鳴スキャナの進歩は、覚醒動物におけるマウス脊髄のイメージングを可能にすることができるが、より速いスキャン時間が必然的に画質を劣化させる信号対雑音比を減少させる。 、現在、脳イメージングに使用脊髄イメージング技術の更なる改善は、これらの障害の多くを克服し、伊那によって導入ポテンシャル交絡を制限することができるdequate組織灌流、 例えば^、31-33。

白質生理学および白質損傷のメカニズムについては知られていることの多くは、 インビトロまたは視神経、末梢神経、および脊髄白質^34-41のストリップからの白質のエクスビボ調製物において使用して決定されている。これらの製剤は、彼らが環境要因で制御さの変化、薬剤や試薬の制御された適用、電気生理学を用いて機能の評価、および生体組織における軸索とミエリンの直接の蛍光顕微鏡観察を可能にするように白質傷害メカニズムの知識を進めるために続けている。しかし、脊髄後カラムストリップまたは腹側白質ストリップから軸索を観察するためにいくつかの以前のアプローチは、不可避的に密接に反対した軸索の応答に影響を与える可能性が除去段階で表面軸索を傷つける。上記の実験操作を活用し、VEのへの損傷を避けるため、それはコードの背側面の直接接触を防止するように、調査中のryの繊維は、我々は、ex vivoで頸髄モデルを使用する。このように、軟膜と隣接する表面的な脊柱軸索のアーキテクチャでは、単離の間生存可能で、非摂動残る。

損傷後の10+時間 – ここでは、それらが動的に最大8リアルタイムで局所損傷に反応するように、中央髄軸索の直接可視化を可能にする比較的単純なアプローチを説明します。レーザー誘起脊髄損傷（LiSCI）モデルが空間的に時間をかけて拘束されたままに原発巣（アブレーション部位）などの一次および二次軸索損傷メカニズムの間の区別を可能にします。オープンバス撮像チャンバは、治療的介入、試薬送達、および環境の操作にアクセス可能である。推定上のaxomyelinic保護剤は、迅速に組織プロセスを伴う長くて費用のかかる実験に対して直接観察によりリアルタイムで評価することができる、る、免疫染色、画像キャプチャ、および分析を区画ため、生きた動物で実験的なエージェントをテストする前に急性応答および保護の操作を評価するための有用な代理モデルを提供します。