Een<em> Ex Vivo</em> Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Degeneratie van axonen is een prominent oorzaak van morbiditeit zelfs diverse neurologische aandoeningen zoals neurotrauma, beroerte, auto-immune en neurodegeneratieve ziekten. Anders dan het perifere zenuwstelsel (PNS), centraal zenuwstelsel (CNS) axonen een beperkte regeneratiecapaciteit eenmaal gewonden door zowel intrinsieke als extrinsieke barrières (dwz remmende moleculen axonale groei geproduceerd gedurende littekenvorming en vrijgemaakt tijdens myelinedegeneratie) ^{1 -7.} Hoewel een aantal van deze belemmeringen zijn uitgebreid onderzocht, therapeutische interventies gericht op CNS axonale degeneratie te voorkomen, bevorderen robuuste axonale regeneratie, en het herstel van functionele connectively, beperkt blijven.

Axonen eenmaal gescheiden van hun soma ondergaan stereotiep werkwijze degeneratie genoemd Wallerian degeneratie die wordt gekenmerkt door axonaal opzwellen, sferoïde vorming en eventuele fragmentatie (beoordeeld ^8). Incontrast, de proximale stomp die in continuïteit met het soma van een doorgesneden perifere axon blijft, vormt een zwelling op zijn einde, sterft terug naar het dichtstbijzijnde knooppunt van Ranvier, en kan dan starten groeikegel vorming, een belangrijke voorwaarde die nodig is voor de daaropvolgende axonale regeneratie ^9-11. In tegenstelling, de proximale axonale uiteinden van veel centrale axonen Kenmerkende "endbulbs" of terugtrekking bollen, niet groei kegels gevormd en in plaats trekken weg van de verwonding waar ze blijven maanden na verwonding ^12-15. Naast de primaire axonale verwonding, kunnen extra axonale schade / verlies eveneens gebeuren axons die voornamelijk worden gespaard van de oorspronkelijke verwonding. Dit vertraagde axonaal verlies van aanvankelijk gespaard axonen wordt aangeduid als secundaire axonale degeneratie. Deze inherente respons van CNS axonen schade maakt functionele axonale regeneratie nog moeilijker doel te bereiken in de hersenen en het ruggenmerg.

Hoewel hallmarks van axonale schade (bv spheroïde vorming, retractie bollen) zijn goed gekarakteriseerd uit post-mortem weefsel en experimentele modellen van axonale degeneratie, heeft opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze dynamische processen is beperkt. De meeste van deze studies zich op statische eindpunt waarnemingen die inherent niet aan individuele axonale reacties in de tijd vast te leggen. Hoewel exogeen toegepaste axonale tracers zijn nuttig axonale reacties verduidelijken statische secties en tijdens live beeldvorming geweest, heeft de beschikbaarheid van genetisch gecodeerde axonale markers sterk verbeterd ons vermogen om axonen in real time via fluorescentie microscopie visualiseren. Inderdaad, een rudimentaire rapport van Kerschensteiner en collega's eerste directe bewijs van axonale degeneratie en regeneratie voorzien in vivo gebruik Thy1 GFP-S muizen die groen fluorescerend eiwit coderen in subsets van neuronen die hun prognoses te sturen in de dorsale kolommen van de wervelkolomkoord ^16. Live beeldvorming benaderingen met behulp van twee foton laser scanning microscopie (TPLSM) en genetische fluorescerend eiwit etikettering van cellen van belang blijft om direct bewijs en mechanistisch inzicht te geven in vele uiteenlopende dynamische processen zoals axonale degeneratie, Ca ²⁺ signalering, axonale regeneratie, astrocyten fysiologie, microglia fysiologie, en de respons op letsel ^17-25.

In tegenstelling tot de neuronen, zeer weinig bekend van myeline op schadelijke stimuli in real-time. Myeline is een essentieel onderdeel van de witte stof geproduceerd en onderhouden door oligodendrocyten in het CZS en Schwann cellen in de PNS. Myeline isoleert 99% van het oppervlak van axonen en daarmee zorgt voor een hoge weerstand, lage capaciteit beschermend omhulsel dat een snelle en efficiënte saltatorische impuls vermeerdering, onlangs beoordeeld door Buttermore et al. ²⁶ ondersteunt. Om de dynamische respons van myeline schade we de solvatochrome, lipofiele vangenfluorescerende kleurstof Nile Red ^27. De solvatochrome eigenschappen van deze vitale vlek laten spectrale verschuivingen van haar emissiespectrum dat afhankelijk is van de fysisch-chemische omgeving ^28,29 is. Deze eigenschappen zijn nuttig om inzicht te krijgen in de mechanismen van axomyelinic letsel en kan worden gevisualiseerd met behulp van geschikt gekozen koudlichtspiegel en emissie-filters of opgelost met behulp van spectrale microscopie ^27. Bijvoorbeeld, Nile Red's emissiespectrum blauw verschoven in minder polaire lipide-rijke omgevingen zoals die gevonden in adipocyten en normale CNS myeline (piekemissie ~ 580-590 nm) ^27. In tegenstelling tot deze vitale kleurstof's emissiespectrum pieken op ~ 625 nm in endbulbs gevormd als axonen ondergaan axonale dieback ^27. Hoewel de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectrale verschuivingen specifiek in endbulbs versus normale myeline onduidelijk blijven, kunnen dergelijke spectrale veranderingen onderliggende veranderingen in eiwitaccumulatie of desorganisatie leidt tot onthullenblootstelling van hydrofobe bindingsplaatsen ^27.

Terwijl in vivo beeldvorming de ultieme criterium voor het waarnemen ruggenmerg axonale letsels dynamiek in hun eigen omgeving, is het technisch moeilijk en aanzienlijke chirurgische deskundigheid vereist en vaak herhalen operaties aan de dorsale kolom die experimentele artefacten kunnen introduceren blootgesteld (bijvoorbeeld ontsteking en littekenvorming vorming). Daarnaast wordt kostbare apparatuur vaak nodig om ophanging en positionering van een intact dier onder de microscoop objectief mogelijk. De dieren moeten zorgvuldig worden gecontroleerd en te zorgen dat ze blijven warm, om ervoor te zorgen vloeistoffen worden bijgevuld, en om ervoor te zorgen dat er geen tekenen van hypoxie als gevolg van langdurige narcose beeldvorming sessies. Het laatste is buitengewoon belangrijk als axonen en myeline absoluut vereist constante perfusie en voldoende zuurstof om levensvatbaar te blijven. Echter vaak niet gerapporteerd of gemonitord meeste in vivo studiesdate. Daarnaast beweging artefacten als gevolg van de hartslag en de ademhaling (isofluraan verdoofd volwassen muis: ~ 300-450 slagen per minuut (BPM) is optimaal tot 97-98% zuurstofverzadiging (normaal tarief ~ 632 BPM) en onderhouden van ~ 55-65 ademhalingen per min (normaal tarief is ~ 163 ademhalingen per minuut), respectievelijk)) ³⁰ tegengekomen tijdens in vivo ruggenmerg beeldvorming make differentiëren primaire en secundaire axonale letsels reacties met behulp van hoge resolutie fluorescentie microscopie uitdagend als zelfs de snelste laser scans onvermijdelijk zijn onderworpen aan deze beweging artefacten. Vooruitgang in ultrasnelle resonante scanners gecombineerd met een implanteerbare stijve vertebrale frame venster kan beeldvorming van de muis ruggenmerg in wakkere dieren toelaten, maar snellere cyclustijden onvermijdelijk de signaal-ruisverhouding beelddegraderende minder worden. Verdere verbeteringen in het ruggenmerg beeldvormende technieken zoals die momenteel worden gebruikt voor beeldvorming van de hersenen kunnen veel van deze obstakels te overwinnen en te beperken potentiële verwart geïntroduceerd door inadequate weefsel perfusie, bijvoorbeeld, ^31-33.

Veel van wat er bekend is over materie fysiologie en mechanismen van stof schade wit wit is bepaald met behulp van in vitro of ex vivo voorbereidingen van de witte stof van de oogzenuw, perifere zenuwen en stroken van het ruggenmerg witte stof ^34-41. Deze preparaten blijven onze kennis van witte stof schade mechanismen vooruit als zij toestaan ​​gecontroleerde veranderingen in omgevingsfactoren, gecontroleerde toepassing van drugs en reagentia, functionele evaluaties met behulp van elektrofysiologie en directe fluorescentie microscopie observaties van axonen en myeline in levend weefsel. Toch een aantal eerdere benaderingen van axonen van het ruggenmerg dorsale kolom stroken of ventrale witte stof stroken in acht onvermijdelijk verwonden oppervlak axonen tijdens het verwijderen stadium dat de reactie van de voet tegen axonen kunnen beïnvloeden. Om te profiteren van de experimentele manipulaties boven en schade te voorkomen aan de very vezels onderzochte, gebruiken we een ex vivo ruggenmerg model zoals het voorkomt direct contact van het dorsale aspect van het koord. Zo is de architectuur van de pia mater en aangrenzende oppervlakkige dorsale kolom axonen levensvatbaar en onverstoord blijven tijdens isolatie.

Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige benadering die directe visualisatie centrale gemyeliniseerde axonen ze dynamisch reageren op een focaal letsel realtime tot 8 laat – 10+ uur na verwonding. De lasergeïnduceerde dwarslaesie (LISCI) model maakt onderscheid tussen primaire en secundaire axonale letsels mechanismen als de primaire laesie (ablatie ter plaatse) blijft ruimtelijk beperkt in de tijd. De open-bad beeldvorming kamer is toegankelijk voor therapeutische interventie, reagens levering, en milieu-manipulaties. Vermeende axomyelinic beschermende middelen kunnen snel worden beoordeeld in real-time door directe waarnemingen versus langdurige en kostbare experimenten met weefsel procesing, snijden, immunokleuring, het vastleggen van beelden, en de analyse en biedt daarom een ​​bruikbaar surrogaat model om acute reacties en beschermende manipulaties beoordelen voordat het testen van de experimentele agenten in levende dieren.