تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا
Summary
توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة التي كتبها التصوير الخلية الحية وكميا.
Abstract
النانوية الفلورسنت (NPS) مع المواد الكيميائية مرغوب فيه، الخصائص البصرية والميكانيكية هي أدوات واعدة لتسمية عضيات داخل الخلايا. هنا، ونحن نقدم طريقة استخدام الذهب-BSA-رودامين مصادر القدرة النووية لتسمية نظام إندو الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة ورصد التلاعب من المضيف مسارات الخلوية من قبل الممرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة. وقد استوعبت مصادر القدرة النووية بسهولة عن طريق خلايا هيلا ومحلية في أواخر الإندوسومات / الجسيمات الحالة. عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الحويصلات وتراكم تلك المصادر في الهياكل غشاء Salmonella- المستحث. نحن نشر حزمة البرامج Imaris للالتحليلات الكمية من الصور مبائر المجهري. وكان عدد من الأشياء وتوزيع حجمها في الخلايا غير المصابة تختلف عن تلك الموجودة في خلايا -infected السالمونيلا، مشيرا إلى إعادة تشكيل للغاية من نظام إندو الليزوزومية التي كتبها WT السالمونيلا.
Introduction
وقد اجتذبت النانوية الفلورسنت (NPS)، بما في ذلك مصادر القدرة النووية المعدنية، ونقاط الكم، البوليمر مصادر القدرة النووية، مصادر القدرة النووية السيليكا، النقاط الكربون وغيرها، اهتماما كبيرا خلال العقود الماضية 1،2. مقارنة الأصباغ العضوية التقليدية، وتبين مصادر القدرة النووية الفلورسنت الكيميائية والخصائص البصرية والميكانيكية مرغوبة، مثل قوة قوية إشارة، ومقاومة للphotobleaching من وارتفاع 3،4 توافق مع الحياة. هذه المزايا تجعل منها طريقة اختيار للاستشعار داخل الخلايا والتصوير الخلية الحية. وعلاوة على ذلك، مجموعة متنوعة من NPS-الإلكترون كثيفة مرئية بواسطة المجهر الإلكتروني (EM)، وتسهيل استخدامها لتحليل مجهري مترابطة، والذي يسمح الجمع بين الخلية الحية تتبع مع المجهر الضوئي (LM) ودقة أعلى في مستوى التركيبية مع EM 5. على سبيل المثال، كانت مصادر القدرة النووية الذهب وقت طويل استخدامها بكفاءة كما أجهزة الاستشعار في خلايا حساسة للتشخيص يعيشون وكذلك في مجال المناعة وضع العلامات 6. الصورة الأخيرةtudies تشير إلى أن مصادر القدرة النووية الذهب مع حجم وشكل مختلف يمكن أن يكون بسهولة امتصاص من قبل مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الخلايا ونقل بشكل روتيني من خلال مسار endosomal، وبالتالي يكون كبيرا يجري المحتمل تطبيقها لداخل الخلايا تتبع النقل حويصلة ووضع العلامات نظام إندو الليزوزومية 7،8 .
مسببات الأمراض الميكروبية، مثل السالمونيلا الملهبة، الشيجلا الفلكسنرية والليستريا المستوحدة، وضعت آليات مختلفة لغزو الخلايا المضيفة غير أكلة 9. بعد أن المنضوية، ومسببات الأمراض، والمترجمة إما في العصارة الخلوية أو عزلها في أماكن محددة الغشاء، تتفاعل على نطاق واسع مع البيئات التي تستضيفهم وتعدل هذه لصالح بقائهم على قيد الحياة 10. على سبيل المثال، السالمونيلا الملهبة لليقيم ويتكاثر داخل phagosomal حجرة داخل الخلايا وصفته السالمونيلا المحتوية فجوة (SCV) عند إصابة 11. وSCV النضجبالاتجار نحو جهاز جولجي، تمر التفاعل المستمر مع مسار التقامي، ويدفع تشكيل الهياكل واسعة أنبوبي، مثل السالمونيلا خيوط يسببها (SIF) والفرز الأنابيب نيكسين، السالمونيلا يسببها الناقل إفرازية البروتين غشاء 3 (SCAMP3) الأنابيب، الخ . 12-14. دراسة كيف يمكن لهذه مسببات الأمراض البكتيرية التلاعب مسارات خلايا المضيف أمر ضروري لفهم الأمراض المعدية.
هنا، تم استخدام مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين كأثر السوائل لتسمية المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية، واستخدم الإنسان الممرض الهضمي السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (السالمونيلا)، وبكتيريا نموذج لدراسة التفاعلات من مسببات المرض مع استضافة المسار التقامي. تم تصوير مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين الخلايا في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع WT السالمونيلا أو سلالات متحولة من قبل متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي (CLSM).ثم تم استخدام البرمجيات Imaris لقياس توزيع مصادر القدرة النووية، مشيرا إلى أن عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الشديد من الإندوسومات / الجسيمات الحالة. وبعد وصف هذا الأسلوب، والتجارب المشابهة يمكن أن تكون مصممة لتتبع مصير طويلة الأجل للمعايير المهنية الوطنية المنضوية وللتحقيق في تأثير المواد الخارجية المختلفة أو العوامل الداخلية على مسار التقامي الخلايا حقيقية النواة.
Protocol
Representative Results
Discussion
النظام إندو-الليزوزومية من خلايا الثدييات يتحكم العمليات الفسيولوجية الهامة، بما في ذلك امتصاص العناصر الغذائية، بوساطة هرمون نقل الإشارة والمراقبة المناعة، وعرض المستضد 17. حتى الآن، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من علامات لوضع العلامات على مسار وتتبع الدراسات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella – at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
