脑的骨髓细胞的表征下列行程可以通过体视用光学分馏方法来进行,或者通过大脑的流式细胞仪分析白细胞悬浮液。两者都是有用的技术来执行,在缺血性脑中发现的主要的骨髓细胞亚群的准确的表型区分。
小胶质细胞的活化,以及血源性巨噬细胞和嗜中性粒细胞的外渗,被认为中风后发挥脑损伤的关键作用。这些骨髓细胞亚群可显示不同的表型和功能,需要加以区别和特点,研究他们的监管和贡献的组织损伤。该协议提供了两种不同的方法对脑免疫细胞特性:精确的体视学方法和流式细胞仪分析。的体视的方法是基于在光学分馏方法,其计算在感兴趣(梗塞脑)的区域的细胞的总数量由系统随机抽样估计。第二表征方法提供了一种简单的方法来隔离脑白细胞悬浮液并通过流式细胞术来表征它们,允许小胶质细胞的表征,渗入的单核细胞和缺血组织的嗜中性粒细胞。此外,它也可为details在小鼠脑缺血模型,只影响大脑皮质,产生高度可重复的梗塞与死亡率的低速率,并且过程进行组织学大脑处理由卡瓦列方法来表征梗死体积。
形态,表型和基因表达的小胶质细胞的改变,以及外渗和激活血源性巨噬细胞和嗜中性粒细胞被认为脑损伤后1-4中的病理生理级联中发挥关键作用。这个协议提供了两种方法来估计局部缺血大脑的不同髓样细胞亚群的数量和执行他们的表型表征。此外,它也提供了脑缺血的小鼠实验模型,它由两个远侧大脑中动脉的暂时或永久的结扎(MCA)和颈总动脉(CCA)的说明,其中包括如何评估梗塞通过使用体视软件精确卡瓦列利方法。
表征缺血脑的骨髓细胞亚群的第一种方法是基于光学分馏方法5一个视学方法。这是最常用的体视探头在生命科学,并提供一个高的精确度与误差5-7的低系数。这是为小区量化的最佳选择,当组织被切段,因为它避免了由于组织成段的碎片对细胞估计偏置。这种方法是一种非常强大的方式来描述数字,动态和缺血组织8的中性粒细胞浸润的亚表型的改变。
第二表征方法是基于从康帕内拉和合作者9的改性协议,它提供了一个简单的方法来隔离脑白细胞悬浮液并通过流式细胞术来表征它们。与传统的免疫组织化学技术,流式细胞术表征允许小胶质细胞之间进行区分(CD45 LO的CD11b +)和渗透基于它们的diff髓样细胞(CD45 您好的CD11b +)CD45 9-13 erent表达水平。另外,促炎性单核细胞(CD45 您好的CD11b +莱曼6G –莱曼6C 喜 ),嗜中性粒细胞(CD45 您好的CD11b +莱曼6G +)和缺血组织的其它白细胞子集能够被区分。这种方法提供了一个可靠和快速检测,以评估脑缺血实验模型神经炎症。然而,组织处理可以影响的激活状态,并在局部缺血组织提供半定量表征发现不同细胞群的编号。
这里介绍的脑缺血模型给出高重现性梗死体积测定24-48小时,MCA结扎用不同的方法8,15,17后7天。此MCAO模型具有低死亡率(小于1%)相比,给他人,最小化在研究中使用的动物数量。获得死亡率率如此之低的一个关键步骤是保持适当的无菌条件,以避免感染诱导中风后可能损害生存。这个MCAO模型不仅可以用作永久性MCAO模型,这被认为是对转化研究18临床相关的模式,但也可作为由CCA和MCA的瞬态结扎一个过渡模型与在期望的时间的活结和后再灌注19。此方法已被成功地用于在小鼠和大鼠17,20。所有这些证据表明,缺血通过结扎脑缺血与多个应用程序的高通用的型号。一个criti这种技术的校准步骤是,它需要在立体显微镜下微创手术;开颅应执行非常小心,以不损坏颧骨以及MCA。然而,(不进行它们经受外科手术,但CCA和MCA结扎)利用假动物提供了有用的工具,以鉴别手术过程依赖效应。脑损伤的以下这种技术的范围内可通过几种方法来量化。我们的脑切片,Nissl染色和由卡瓦列体积的随后估计的协议允许对受损区域的精确量化,最大限度地减少在这种类型的研究中所使用的串行自脑切片也可以用于不同的免疫组织化学分析的小鼠的数目。对于这种方法的一个更好的性能,这是至关重要的,以选择在体视软件中使用的适当的参数( 表1),这将是必要的,用于估计第Ë体积的不同区域的由式:V = 1 / SSF * A F * T *ΣPI(SSF是片抽样比,t为各部分的平均厚度,f是网格间距的面积和ΣP点撞击结构的数量)。
远端MCAO通过连接可以是有用的表征渗透白细胞和免疫细胞亚群8,13参与脑损伤后1-4的炎症过程。在这里,我们提出了两种不同的方法对脑免疫细胞特性,精确的体视学方法和流式细胞仪分析表征好多个白细胞亚群。
趁着串行脑切片,嗜中性粒细胞的总数的定量可通过光学分馏方法16,其估计的细胞的总数量从细胞取样机智的数量来实现HA系统随机抽样(SRS)一套公正的虚拟计算空间覆盖感兴趣的整个区域,在我们的例子中梗死区域,不带偏见的虚拟计算空间之间的距离均匀的方向的X,Y和Z.该方法提供了一个准确的工具结扎后估计在不同的时间在局部缺血性脑总嗜中性粒细胞数。虽然它没有被在本研究中所示,该协议也可以被局部缺血21之后以及在像其他浸润白细胞的局部缺血性脑发现的任何其他细胞群的准确定量用于估计不同的中性粒细胞亚群(单核细胞/巨噬细胞)而且估计存活的神经元,甚至中风后神经量化。为准确估计在所期望的区域中的最重要的步骤是适当的参数的选择,如图所示的那些表3中用于在缺血区的中性粒细胞的定量。这些参数将被用于在体视软件通过使用等式N =ΣQ-×1 / SSF×1 / ASF×1 / TSF(ΣQ-是细胞计数的总数来计算总阳性细胞数目(N)的分馏,社保基金的部分采样率,ASF是采样率区域,TSF是抽样比厚度)5。虽然这种方法比其它量化方法要慢(例如,中性粒细胞标记物通过组织,代表图像或每场的中性粒细胞的数量的密度的毫克分析),它具有的优点是无偏和固体技术,该技术提供了精确的定量细胞数。
大脑白细胞隔离方法允许同时识别和几种免疫细胞亚型的定量,而不需要偏压系统通过体内染色或遗传操作。随后的细胞从其特征髓P分拣opulations或它们的免疫磁性分离,可用于多种下游应用,如基因或蛋白质表达的进一步研究。的嗜中性粒细胞,单核细胞和小胶质细胞用这种方法获得的精确表征提供高特异性相对于现有的方法,如免疫组织化学研究中,一个优点是,允许分配特定的功能,以不同的骨髓细胞介导脑先天免疫应答。此外,它可以进一步扩展到使用相应的标签表征其他脑种群,如血液出生的巨噬细胞(细胞CD11b + CD45 您好 CD68 +),并且其可以应用于用于其它CNS病症或损伤的研究。因此,该技术提供了一种重要的工具,以探索在脑炎症反应的异质性。这种技术的主要局限性在于从新鲜的脑组织的白细胞悬浮液的制备方法,它可以改变所述细胞或它们的抗原变更激活状态。尽管该技术允许一个更详细的定性表征相比免疫组化研究,它提供了基于细胞的分离较不准确的定量。尽管这样,我们的细胞分离协议的效率类似于其他发表的方法9,它可以有效地用于检测甚至经受不同处理8 MCAO组之间的控制和缺血组之间或脑的免疫细胞的数目的差异。
关键步骤这个协议是组织解剖,组织破坏过程,以及髓磷脂的去除。关于组织采集,归一化步骤可以包括(通过称重收集的组织),以避免变性,由于不同解剖表演。此外,还可发生梗死体积不同的缺血组关系正常化(此前磁R所确定esonance)。另一种方式来解决这个问题的方法是使用两个缺血组和对照组的整个同侧半球,或者甚至使用缺血小鼠的对侧半球作为对照,以尽量减少使用的动物的数量。虽然这种方法避免了每个夹层之间的差别,它有一个主要的缺点;稀释因子由增加的细胞的总数,但尚未髓细胞是专门设在同侧皮层的芯和梗死周围区域的数量增加。关于组织破坏,该协议说明的步骤对脑细胞的机械破碎,避免酶处理和防止表面抗原蚀变9,22,对于炎性细胞亚群的进一步定性和定量分析的重要问题。另外所关注的细胞悬浮液的制备,从脑样品髓鞘去除是高度推荐的步骤,以避免与downst干扰令的应用,如免疫细胞分离或流式细胞术23,24。这可以用不同的方法,如蔗糖或珀梯度,或抗髓鞘珠来实现。在这里,并根据该比较用的Percoll使用不同的方法对脑细胞悬浮液分离,机械破碎组合以除去髓鞘用于提高细胞产量和存活率25以前的研究。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |