الدماغ خلايا الدم النخاعي توصيف التالية السكتة الدماغية يمكن أن يؤديها التجسيم باستخدام طريقة المجزئ البصرية، أو عن طريق تحليل تدفق cytometric من الدماغ الكريات البيض تعليق. كلاهما تقنيات مفيدة لإجراء تمييز phenotypical دقيق لأهم مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي وجدت في الدماغ الدماغية.
تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، فضلا عن تسرب الضامة haematogenous والعدلات، ويعتقد أن تلعب دورا محوريا في إصابات الدماغ بعد السكتة الدماغية. ويمكن لهذه القطعان خلية الدم النخاعي عرض الظواهر وظائف مختلفة وتحتاج إلى أن تكون متميزة وتتميز لدراسة تنظيم ومساهمتها في تلف الأنسجة. يوفر هذا البروتوكول اثنين منهجيات مختلفة للدماغ توصيف الخلايا المناعية: نهج stereological دقيقة وتحليل تدفق cytometric. ويستند هذا النهج stereological على طريقة المجزئ البصري، الذي يحسب العدد الكلي للخلايا في منطقة من الفائدة (الدماغ محتشية) حسب تقديرات عينة عشوائية منتظمة. يوفر نهج توصيف الثاني طريقة بسيطة لعزل تعليق الكريات البيض الدماغ وتميز لهم من قبل التدفق الخلوي، مما يسمح لتوصيف الخلايا الدبقية الصغيرة، تسللت وحيدات والعدلات من الأنسجة الدماغية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه أيضا دetails على نموذج نقص التروية الدماغية لدى الفئران التي تؤثر بشكل حصري قشرة الدماغ، وتوليد عوائق استنساخه للغاية مع انخفاض معدل الوفيات، وإجراءات لمعالجة الدماغ النسيجي لتوصيف حجم احتشاء بواسطة طريقة كافاليري.
ويعتقد المورفولوجية والمظهرية والتعبير الجيني التعديلات من الخلايا الدبقية الصغيرة، فضلا عن تسرب وتفعيل الضامة haematogenous والعدلات أن تلعب دورا محوريا في سلسلة الفيزيولوجية المرضية التالية إصابات الدماغ 1-4. يوفر هذا البروتوكول نهجين لتقدير عدد من مجموعات فرعية مختلفة خلية الدم النخاعي من الدماغ الدماغية وأداء توصيف لها phenotypical. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر أيضا وصفا للنموذج تجريبي من نقص التروية الدماغية لدى الفئران، والذي يتألف من ربط عابرة أو دائمة من كلا البعيدة الدماغي الأوسط الشريان (MCA) والشريان السباتي المشترك (CCA)، بما في ذلك كيفية تقييم احتشاء من خلال طريقة كافاليري دقيقة باستخدام البرمجيات stereological.
النهج الأول للتميز مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي من الدماغ الدماغية هي طريقة stereological تستند إلى نهج المجزئ بصري 5. وهذا هو الأكثريشيع استخدامها التحقيق stereological في علوم الحياة ويوفر درجة عالية من الدقة مع معاملات منخفضة من الخطأ 5-7. هذا هو أفضل خيار لالكمي الخلية عندما يتم قطع الأنسجة إلى أقسام، كما أنه يتجنب التحيز على تقدير خلية بسبب تفتت الأنسجة إلى أقسام. هذا الأسلوب هو وسيلة قوية جدا لوصف الأرقام، وديناميات والتغيرات المظهرية المجموعات السكانية الفرعية العدلات تسلل من الأنسجة الدماغية 8.
ويستند هذا النهج توصيف الثاني على بروتوكول تعديل من كامبانيلا والمتعاونين 9 التي توفر طريقة بسيطة لعزل الدماغ تعليق الكريات البيض وتميز لهم من قبل التدفق الخلوي. وعلى النقيض من تقنيات المناعى التقليدية، التدفق الخلوي توصيف يسمح التفريق بين الخلايا الدبقية الصغيرة (CD45 لو CD11b +) وتسلل خلايا الدم النخاعي (CD45 مرحبا CD11b +) على أساس فرق بهممستويات erent التعبير عن CD45 9-13. وبالإضافة إلى ذلك، وحيدات الموالية للالتهابات (CD45 مرحبا CD11b + لي-6G – لي-6C مرحبا)، العدلات (CD45 مرحبا CD11b + لي-6G +) والكريات البيض الأخرى مجموعات فرعية من الأنسجة الدماغية يمكن تمييزها. ويوفر هذا النهج مقايسة موثوق وسريع لتقييم neuroinflammation في نماذج تجريبية من نقص تروية الدماغ. ومع ذلك، يمكن معالجة الأنسجة تؤثر على الدولة تفعيل وأعداد السكان خلية مختلفة وجدت في الأنسجة الدماغية توفير توصيف شبه الكمي.
نموذج نقص التروية الدماغية قدم هنا يعطي تحدد حجم احتشاء استنساخه للغاية 24-48 ساعة و 7 أيام بعد MCA ربط بمناهج مختلفة 8،15،17. هذا النموذج MCAO لديه انخفاض معدل وفيات (أقل من 1٪) بالمقارنة مع الآخرين، والتقليل من عدد الحيوانات المستخدمة في الدراسات. خطوة حاسمة للحصول على هذا المعدل المنخفض للوفيات هو الحفاظ على ظروف معقمة المناسبة لتجنب الإصابة بالأمراض التي يمكن أن تؤثر البقاء على قيد الحياة بعد السكتة الدماغية الاستقراء. لا يمكن هذا النموذج MCAO أن تستخدم فقط كنموذج MCAO دائم، والتي تعتبر نموذجا السريرية ذات الصلة للبحوث متعدية 18، ولكن أيضا باعتبارها نموذجا انتقاليا التي كتبها عابرة ربط التقييم القطري المشترك وMCA مع العقدة والخلفي ضخه في الوقت المطلوب 19. تم عرض هذه الطريقة استخدمت بنجاح في الفئران والجرذان 17،20. كل هذه الأدلة تشير إلى أن MCAO بواسطة الربط هو نموذج تنوعا عال من نقص التروية الدماغية مع تطبيقات متعددة. وcritiكال خطوة من هذا الأسلوب هو أنه يتطلب جراحة تحت stereomicroscope. يجب أن يتم تنفيذ حج القحف بعناية فائقة حتى لا تتلف العظم الوجني وكذلك MCA. ومع ذلك، فإن استخدام الحيوانات صورية (التي تخضع لعملية جراحية ولكن التقييم القطري المشترك وربط MCA لم يتم تنفيذ) يوفر أداة مفيدة لتمييز الآثار التي تعتمد على إجراء العمليات الجراحية. مدى إصابات الدماغ التالية هذه التقنية يمكن قياسها كميا بواسطة عدة طرق. لدينا بروتوكول باجتزاء الدماغ، نيسل تلطيخ وتقدير لاحق من مستوى الصوت عن طريق كافاليري يسمح لتقدير دقيق للمنطقة المتضررة ويقلل من عدد من الفئران المستخدمة في هذا النوع من الدراسات منذ أقسام الدماغ المسلسل يمكن أن تستخدم أيضا لمختلف تحليل المناعى. لأداء أفضل لهذه المنهجية، فمن الأهمية بمكان لاختيار المعلمات المناسبة المستخدمة في البرنامج التجسيم (الجدول 1) والتي سوف تكون ضرورية لتقدير عشرحجم (ه) من مختلف المناطق من قبل صيغة: V = 1 / SSF * لو ر * * ΣP ط (SSF هو جزء أخذ العينات شريحة، ر هو سمك متوسط من الأقسام، وو هي المنطقة من التباعد الشبكة و ΣP عدد النقاط ضرب بنية).
وMCAO القاصي قبل ربط يمكن أن تكون مفيدة لتوصيف الكريات البيض وتسلل مجموعات سكانية فرعية الخلايا المناعية 8،13 التي تشارك في العملية الالتهابية التالية إصابات الدماغ 1-4. هنا، نقترح اثنين منهجيات مختلفة لتوصيف الخلايا المناعية في المخ، واتباع نهج stereological دقيقة وتحليل تدفق cytometric لوصف أفضل الكريات البيض متعددة القطعان.
الاستفادة مسلسل باجتزاء الدماغ، الكمي لعدد من العدلات يمكن تحقيقه من خلال طريقة المجزئ بصري 16، الذي يقدر العدد الكلي للخلايا من عدد الخلايا خفة دم عيناتهكتار المنهجي عينة عشوائية (SRS) مجموعة من المساحات منحازة افتراضية العد تغطي المنطقة بأكملها من الفائدة، في حالتنا المنطقة احتشاء، وعلى مسافة موحدة بين المساحات العد افتراضية متحيزة في اتجاهات X، Y وZ. يوفر هذا الأسلوب أداة دقيقة ل تقدير مجموع أرقام العدلات في الدماغ الدماغية في أوقات مختلفة بعد ربط. على الرغم من عدم تبين في هذه الدراسة، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لتقدير القطعان العدلات مختلفة بعد نقص التروية 21 و لالكمي الدقيق لأية مجموعة من السكان خلية أخرى وجدت في الدماغ الدماغية مثل الكريات البيض تسلل الأخرى (وحيدات / الضامة) وأيضا لتقدير الخلايا العصبية على قيد الحياة أو حتى لتكوين الخلايا العصبية الكمي بعد السكتة الدماغية. أهم خطوة لتقدير دقيق في المنطقة المرغوبة هي اختيار المعلمات المناسبة، كما هو مبين في تلك الموجودة في الجدول رقم 3 لتقدير العدلات في المنطقة الدماغية.وسوف تستخدم هذه المعايير لبرنامج التجسيم لحساب إجمالي عدد الخلايا إيجابية (N) باستخدام المعادلة N = ΣQ- × 1 / SSF × 1 / محامون بلا حدود × 1 / TSF (ΣQ- هو العدد الكلي للخلايا عدها مع والمجزئ، SSF هو المقطع أخذ العينات جزء، محامون بلا حدود هي المنطقة جزء أخذ العينات، وTSF هو سمك جزء أخذ العينات) 5. على الرغم من أن هذه المنهجية هي أبطأ من تقنيات القياس الكمي أخرى (على سبيل المثال، وتحليل علامات العدلة من قبل ملغ من الأنسجة، وكثافة الصور التمثيلية أو عدد العدلات في الميدان)، فإنه لديه ميزة أن تكون غير منحازة وتقنية الصلبة التي توفر دقة الكمي لأعداد الخلايا.
نهج العزلة الكريات البيض الدماغ يسمح لتحديد وقت واحد والكمي لعدة أنواع فرعية الخلايا المناعية دون الحاجة للانحياز النظام عن طريق تلطيخ في الجسم الحي أو التلاعب الجيني. خلية اللاحقة الفرز من ص النخاعي تتسمopulations أو انفصالهما immunomagnetic يمكن استخدامها لتطبيقات المصب متعددة، مثل إجراء المزيد من الدراسات على الجين أو البروتين التعبير. توصيف دقيق للالعدلات، وحيدات الخلايا الدبقية الصغيرة والتي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب يوفر خصوصية عالية فيما يتعلق بأساليب القائمة مثل دراسات المناعى، وهي ميزة تسمح للتخصيص وظائف محددة لخلايا الدم النخاعي المختلفة التي تتوسط الدماغ الاستجابة المناعية الفطرية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن تمديدها لتوصيف السكان الدماغ الأخرى مع التسمية المناسبة، مثل الدم ولدت الضامة (CD11b + CD45 CD68 + مرحبا)، وأنه يمكن تطبيقها لدراسة أمراض الجهاز العصبي المركزي أخرى أو إصابات. وبالتالي توفر هذه التقنية أداة أساسية لاستكشاف تجانس الاستجابة الالتهابية في الدماغ. والقيد الرئيسي لهذا الأسلوب موجود على إعداد تعليق الكريات البيض من أنسجة المخ الطازجة، والتي يمكن أن تغيرالدولة تفعيل الخلايا أو تغيير المستضد بهم. على الرغم من أن هذه التقنية تتيح للتوصيف نوعي أكثر تفصيلا بالمقارنة مع دراسات المناعى، فإنه يوفر الكمي أقل دقة تعتمد على العزلة الخلية. على الرغم من هذا، فإن كفاءة دينا بروتوكول العزلة خلية مشابهة لمنهجيات أخرى نشرت 9 وأنه يمكن استخدامها بكفاءة لكشف الفروق في عدد من الدماغ الخلايا المناعية بين السيطرة والجماعات MCAO أو حتى بين الجماعات MCAO تعرض للعلاجات المختلفة 8.
خطوات حاسمة من هذا البروتوكول هي تشريح الأنسجة، والإجراء تعطيل الأنسجة، وإزالة المايلين. فيما يتعلق بجمع الأنسجة، ويمكن أن تدرج خطوة التطبيع (عن طريق وزن الأنسجة التي تم جمعها) لتجنب التقلبات بسبب العروض تشريح مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تحدث التطبيع بين الجماعات MCAO مختلفة من خلال حجم احتشاء (التي سبق تحديدها من قبل R المغناطيسيesonance). وهناك طريقة أخرى لحل هذه المشكلة هو استخدام نصف الكرة المماثل كاملة من كلا المجموعتين الدماغية والسيطرة، أو حتى استخدام نصف الكرة الأرضية المقابل من الفأرة الدماغية كعنصر تحكم لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة. في حين أن هذا النهج يتجنب الاختلافات بين كل تشريح، أن لديها العيب الرئيسي. يتم إضافة عامل التخفيف عن طريق زيادة العدد الكلي للخلايا ولكن ليس عدد خلايا الدم النخاعي التي تقع حصرا في المجالات الأساسية وشبه احتشاء من القشرة المماثل. وفيما يتعلق تعطيل الأنسجة، ويوضح هذا البروتوكول الخطوات لتعطيل الميكانيكي للخلايا الدماغ، وتجنب العلاجات الأنزيمية ومنع سطح المستضد تغيير 9،22، وهي مسألة أساسية لمزيد من التحليل النوعي والكمي للمجموعات سكانية فرعية الخلايا الالتهابية. بالإضافة إلى إعداد تعليق خلية من الفائدة، وإزالة النخاعين من عينات الدماغ هي خطوة للغاية وأوصت لتجنب التداخل مع downstتطبيقات ماعون من الورق، مثل فصل الخلية immunomagnetic أو التدفق الخلوي 23،24. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام أساليب مختلفة، مثل السكروز أو التدرجات Percoll، أو حبات مكافحة المايلين. هنا، واستنادا إلى الدراسات السابقة التي تقارن بين الطرق المختلفة لخلايا الدماغ تعليق العزلة، واختلال الميكانيكية في تركيبة مع استخدام Percoll لإزالة المايلين يستخدم لتحسين المحاصيل الخلايا وقدرتها على البقاء 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |