에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화
Summary
허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino – 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.
Abstract
허혈성 뇌 손상은 적절한 뇌 기능을 저하 가장 일반적이고 치명적인 상태 사이이며 종종 영향 환자에서 기능적 결손을 지속 리드. 집중적 인 연구 노력에도 불구하고, 여전히 신경 세포의 손상을 줄이고 지연 보조 죽음 허혈 영역의 신경 세포를 보호 가능한 효과적인 치료 옵션이 없습니다. 이 분야의 연구는 일반적으로 문제가 정교하고 동물 모델의 사용을 포함한다. 산소와 포도당 결핍 (OGD)에 도전 Entorhino – 해마의 Organotypic 슬라이스 문화는 뇌허혈을 모방 생체 모델에서 설정됩니다. 본 연구의 목적은 신규 한 뇌 혈관의 변화가 비교 상관 될 수있는 변경 및 신경 신경 혈관 구획과 구획 모두 반응 이외에 다룬다는 것이다. 이 프로토콜에서 제시된 방법은 실질적으로의 잠재적 인 응용 범위를 확장하거나ganotypic 슬라이스 문화 접근 방식. OGD 또는 단독 저산소증 유도의 Organotypic 슬라이스 문화 오히려 간단한 방법에 의해 적용하고 신경 조직의 신뢰성과 재현성 손상에 이르게 할 수 있습니다. 이 생체 내에서 뇌졸중 및 허혈을 유도 복잡하고 문제가 동물 실험 완전히 대조적이다. 분석을 확대하여 보존하고 뇌 기능을 복원하는 방법에 대한 새로운 방법을 제공 할 수있는 혈관의 반응에 대한 연구를 포함합니다. 여기에 제시된 슬라이스 문화 접근 방식은 허혈성 뇌 손상의 연구를위한 매력적이고 중요한 도구로 발전 할 수 있으며 신경 보호하기위한 잠재적 인 치료 대책을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다.
Introduction
중추 신경계는 혈관에 의한 손실이나 산소와 포도당 공급의 감소에 특히 민감하다. 뇌에 혈액을 공급하더라도 다소 짧은 중단 일반적인 스트로크 증후군 선도 중요한 뇌 영역의 기능에 영구적 손실을 유도 할 수있다. 주 영향 영역에서 신경 세포 손실에 더하여, 일반적으로 이차 손상으로 인한 추가적인 지연 성 뉴런의 손실이있다. 불행하게도 지금까지 차 신경 죽음의 감소에 대한 신경 치료는 1 사용할 수 없습니다. 이차 손상의 기전 연구를위한 연구 노력은 중간 대뇌 동맥 폐쇄 다양한 혈전 폐색 기법 등 뇌허혈 동물 모델의 사용에 의존한다 (검토를 위해 최근 2 참조). 병렬로 인해 제한 및 동물 모델, 다양한 CNS 조직의 Organotypic 슬라이스 문화의 사용과 윤리적 인 문제로 스튜를 허용하는 사용되었다상해 3-5의 다양한 유형에 대한 신경 반응의 마구.
허혈성 뇌 손상을 모방하는 조건 하에서 반응 신경 연구를위한 산소 포도당 박탈 모델 시스템 (OGD)가 개발되었다. 이 모델에서, 슬라이스 문화 일시적 글루코스 부족과 산소의 부재하에 질소 가스로 평형화 한 매체에 노출된다. 이러한 처리로, 생체 6,7 허혈성 손상 후 관찰 된 것과 다소 유사하다 신경 손상 및 손실을 유도 할 수있다. 해마에서, 이러한 치료에 특히 CA1에서 신경 세포 손실을 유발하지만 CA3 영역 또는 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus). 반대로, 슬라이스 배양 혈관 반응 연구는 지금까지 광범위하게 수행되지 않았다. 명백한 이유는 슬라이스 배양 모델에서 순환과 혈관 관류의 부족이다. 그러나, 우리는 B를 유지하는 것이 가능하다는 것을 미리 보여 주었다CNS에서들 (100d) 선박은 9, 몇 일 8 문화를 슬라이스.
이 방법의 전반적인 목표는 OGD 후 신경 세포의 운명을 모니터링하지만 부상 응답의 중요한 부분입니다 혈관의 운명과 리모델링에 대한 연구를 확장 할뿐만 아니라. 지금까지 이러한 연구는 동물 실험의 사용 필수있다 (. 데 용 등, 1999; Cavaglia 등, 2001.). 프로토콜이 여기에 제시, 우리는 이러한 연구는 저산소증으로 또는 둘 다 신경 세포의 생존과 혈관 반응의 분석을 다음에 흥분 독성 병변 중 하나에 도전 entorhino – 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 상세하게 할 수있는 방법. 이 프로토콜은이 주제 10에 이전에 출판 된 연구를 바탕으로하며, 중추 신경계의 신경 혈관의 상호 작용에 관심이있는 실험실 유용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 방법으로, 해마의 Organotypic 슬라이스 문화는 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하기 위해 다양한 도구로 사용할 수 있습니다. Organotypic 슬라이스 배양 혈관 변화의 동시 연구의 새로운 형태 7, 6 허혈 후 신경 반응을 연구를 위해 이전에 사용 되었으나 크게이 방법의 응용 가능성을 향상시킨다. OGD 또는 단독 저산소증 유도의 Organotypic 슬라이스 문화 오히려 간단한 방법…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 바젤 대학의 생물 의학 교실 및 스위스 국립 과학 재단 (31003A_141007)에 의해 지원되었다. 마르쿠스 Saxer 기술 지원을 제공했다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
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