Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.
Lésion cérébrale ischémique est parmi les affections les plus courantes et les plus dévastatrices de compromettre le bon fonctionnement du cerveau et conduit à la persistance des déficits fonctionnels chez les patients atteints souvent. Malgré les efforts de recherche intensifs, il n'y a toujours pas de traitement efficace disponible qui réduit une lésion neuronale et protège les neurones dans les zones ischémiques du secondaire mort retardée. La recherche dans ce domaine implique généralement l'utilisation de modèles animaux élaborés et problématiques. Cultures organotypique Entorhino-hippocampique contestées par manque d'oxygène et de glucose (OGD) sont établis dans des modèles in vitro qui imitent l'ischémie cérébrale. Le nouvel aspect de cette étude est que les modifications des vaisseaux sanguins du cerveau sont étudiés, en plus de modifications neuronales et la réaction à la fois le compartiment et le compartiment neuronal vasculaire peut être comparée et corrélée. Les méthodes présentées dans ce protocole d'élargir considérablement les applications potentielles de la ouganotypic approche de la culture de la tranche. L'induction de l'hypoxie ou OGD seul peut être appliquée par des moyens relativement simples dans des cultures de tranches organotypiques et entraîne des dommages fiable et reproductible dans le tissu neural. Ceci est en contraste frappant avec les expériences sur les animaux complexes et problématiques induisant accident vasculaire cérébral et ischémie in vivo. En élargissant l'analyse pour inclure l'étude de la réaction du système vasculaire pourrait fournir de nouveaux moyens sur la façon de préserver et de restaurer les fonctions cérébrales. L'approche de la culture de la tranche présentée ici pourrait se développer en un outil intéressant et important pour l'étude des lésions cérébrales ischémiques et pourrait être utile pour tester des mesures thérapeutiques potentielles visant à la neuroprotection.
Le système nerveux central est particulièrement sensible à une perte ou une réduction de l'oxygène et de glucose alimentation par le système vasculaire. Même une assez courte interruption de l'approvisionnement en sang au cerveau peut provoquer une perte permanente de la fonction des zones du cerveau concernées mènent aux syndromes de temps typiques. En plus de la perte neuronale dans les zones touchées primaires, il existe généralement une perte neuronale retardée supplémentaire à travers des dommages secondaires. Malheureusement, jusqu'à présent, aucun traitement neuroprotecteur pour la réduction de la mort neuronale secondaire était disponible 1. Les efforts de recherche pour étudier les mécanismes de dommages secondaires reposent sur l'utilisation de modèles animaux d'ischémie cérébrale comme l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et diverses techniques d'occlusion thrombotique (pour une revue récente, voir 2). En parallèle, également en raison de limitations d'ordre éthique avec l'utilisation de modèles animaux, la culture organotypique de divers tissus du système nerveux central ont été utilisés qui permettent à l'étudy de réactions neuronales à différents types de blessures 3-5.
Pour l'étude de la réaction neuronale dans des conditions qui imitent les lésions cérébrales ischémiques, le système de modèle de privation d'oxygène et de glucose (OGD) a été développé. Dans ce modèle, les cultures de tranches sont temporairement exposées à un milieu dépourvu de glucose et a été équilibrée avec de l'azote gazeux en l'absence d'oxygène. Avec un tel traitement, il est possible d'induire une lésion neuronale et la perte qui est assez similaire à celui observé après une lésion ischémique in vivo 6, 7. Dans l'hippocampe, ce traitement induit une perte neuronale dans CA1 spécifiquement, mais pas dans l' région CA3 ou le gyrus denté de l'hippocampe. En revanche, l'étude des réactions vasculaires dans des cultures de tranches jusqu'à présent n'a pas été largement engagé. Une raison évidente est l'absence de circulation et de perfusion vaisseau sanguin dans le modèle de culture de la tranche. Cependant, nous avons montré précédemment qu'il est possible de maintenir bvaisseaux Lood du SNC tranche cultures pendant plusieurs jours 8, 9.
L'objectif global de cette méthode est de surveiller non seulement le sort des neurones après les autres ministères mais étendre l'étude sur le sort et le remodelage du système vasculaire qui est une partie importante de la réponse de blessure. Jusqu'à présent, de telles études ont nécessité l'utilisation de l'expérimentation animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Dans le protocole présenté ici, nous allons détailler la façon dont ces études peut être fait dans les cultures organotypique entorhino-hippocampique attaqué ni à l'hypoxie ou par des lésions excitotoxiques suivie d'une analyse des deux réactions de survie et des vaisseaux sanguins neuronales. Ce protocole est basé sur une étude publiée précédemment sur ce sujet 10 et peut être utile pour tout laboratoire s'intéresse aux interactions neurovasculaires dans le SNC.
Avec les méthodes présentées ici, les cultures organotypiques d'hippocampe de tranche peuvent être utilisés comme un outil polyvalent pour étudier les changements en matière plastique dans le tissu neuronal après une blessure. Bien que les cultures de tranches organotypiques ont été utilisés dans le passé pour l'étude de réactions neuronales après une ischémie de 6, 7, du nouvel aspect de l'étude simultanée de changements vasculaires améliore considérablement les applications p…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'Université de Bâle, Département de la biomédecine, et le Fonds national suisse (31003A_141007). Markus Saxer a fourni un appui technique.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
TTX | R&D systems | 1078/1 | |
polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
Alexa anti mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
Alexa anti mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
Alexa anti rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
Alexa anti rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |