التصوير في الوقت الحقيقي من محور عصبي نقل الكم دوت المسمى عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الابتدائية
Summary
نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية الدماغي، وهو عامل التغذية العصبية، هو أمر حاسم لبقاء وظيفة العديد من السكان العصبية. وتتميز بعض الاضطرابات التنكسية من اختلال هيكل محور عصبي وظيفة. أثبتنا التقنيات المستخدمة لدراسة الاتجار المباشر لQD-عامل التغذية العصبية في غرف ميكروفلويديك باستخدام الخلايا العصبية الأولية.
Abstract
عامل التغذية العصبية تلعب دورا هاما في العديد من جوانب بقاء الخلايا العصبية، والتمايز، والوظيفة. وينظر بشكل متزايد العجز الهيكلية والوظيفية في محاور كميزة المبكرة من أمراض الاعصاب، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض هنتنغتون (HD). حتى الآن غير واضح هو آلية (ق) التي يتم الناجم عن إصابة محور عصبي. أبلغنا تطوير تقنية جديدة لإنتاج نشطة بيولوجيا، monobiotinylated عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF) التي يمكن استخدامها لتتبع نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية. تم إنتاج عامل التغذية العصبية الكم نقطة المسمى (QD-عامل التغذية العصبية) عن طريق التصريف النقطة الكمومية 655 إلى mBtBDNF. تم استخدام جهاز ميكروفلويديك لعزل المحاور من أجسام الخلايا العصبية. إضافة QD-عامل التغذية العصبية إلى المقصورة محور عصبي سمحت التصوير الحي للنقل عامل التغذية العصبية في محاور عصبية. أثبتنا أن QD-عامل التغذية العصبية انتقلت أساسا retrogradely حصرا، مع عدد قليل جدا من توقف، في سرعة التحرك نحو 1.06 ميكرون / ثانية. هذا النظام يمكن أن تستخدم لتحقيق ليchanisms من تعطل وظيفة محور عصبي في AD أو HD، فضلا عن الاضطرابات التنكسية الأخرى.
Introduction
الخلايا العصبية مستقطبة للغاية الخلايا التي عمليات طويلة وغالبا ما وضعت للغاية تعتبر أساسية لإنشاء والحفاظ على بنية ووظيفة الدوائر العصبية. محور عصبي يلعب دورا حيويا في تحمل البضائع من وإلى نقاط الاشتباك العصبي. البروتينات والعضيات توليفها في سوما الخلية تحتاج ليتم نقلها من خلال محاور للوصول إلى المحطة قبل المشبكي لدعم وظيفة الخلايا العصبية. في المقابل، تلقت إشارات تحتاج في محاور البعيدة ليتم transduced ونقلت إلى سوما. هذه العمليات ضرورية لبقاء الخلايا العصبية، والتمايز، والصيانة. يجب أن تجرى في أن النقل محور عصبي في بعض الخلايا العصبية من خلال مسافات أكثر من 1،000 مرة من قطر جسم الخلية، وتصور إمكانية بسهولة أنه حتى العجز صغيرة يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا العصبية والدائرة.
الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (عامل التغذية العصبية)، وهو عضو من عائلة neurotrophin من عوامل النمو، موجود في أماهمناطق الدماغ نيويورك، بما في ذلك الحصين والقشرة المخية، والدماغ الأمامي القاعدية. عامل التغذية العصبية تلعب دورا حاسما في تشكيل الإدراك والذاكرة من خلال دعم بقاء، والتمايز، ووظيفة الخلايا العصبية التي تشارك في الدوائر المعرفية. عامل التغذية العصبية يربط مستقبله، والتيروزين كيناز TrkB، في محطة محوار حيث ينشط مسارات الإشارات بوساطة TrkB بما في ذلك mitogen تنشيط بروتين كيناز / خارج الخلية التنظيم إشارة بروتين كيناز (MAPK / إرك)، فوسفتيدلينوستول-3-كيناز (PI3K) وفسفوليباز C-جاما (PLCγ). يتم تعبئتها البروتينات التي تشارك في هذه الممرات مما يشير إلى هياكل حويصلي التقامي لتشكيل عامل التغذية العصبية / TrkB يشير دخلول؛ جسيم داخلي 1-6 التي يتم نقلها بعد ذلك إلى retrogradely سوما العصبية.
غرفة ثقافة ميكروفلويديك هي عبارة عن منصة مفيدة جدا لدراسة البيولوجيا محور عصبي في ظل ظروف طبيعية، وكذلك في تحديد الإصابة والمرض 7،8. بواسطة محاور عزلمن أجسام الخلايا، سمح جهاز واحد لدراسة النقل وتحديدا في محاور 8-10. منصات ميكروفلويديك PDMS مقرها مع 450 ميكرون الحواجز مرسمة مجهارية المستخدمة في هذه الدراسة تم شراؤها تجاريا (انظر الجدول المواد). لدراسة نقل عامل التغذية العصبية الدماغي، قمنا بتطوير تكنولوجيا جديدة لإنتاج عامل التغذية العصبية monobiotinylated (mBtBDNF). ونحن قد استفادت من الببتيد البيوتين متقبل، AP (المعروف أيضا باسم AviTag). وهو تسلسل الأحماض الأمينية 15 الذي يحتوي على بقايا يسين التي يمكن و ligated تحديدا إلى البيوتين من قبل كولاي يغاز انزيم البيوتين، البيرة. نحن تنصهر في AviTag إلى C-محطة من الفأرة قبل proBDNF [كدنا] بواسطة PCR (الشكل 1A). تم استنساخ بناء إلى متجه التعبير الثدييات، pcDNA3.1 MYC-له النواقل. نحن أيضا استنساخ الحمض النووي البكتيري البيرة في pcDNA3.1 MYC-له النواقل. البلازميدات كانا عابر شارك transfected-إلى خلايا HEK293FT للتعبير عن كل من البروتينات. البيرة المحفز للربط من بيوفي خصيصا ليسين يقيمون داخل AviTag في C-محطة من عامل التغذية العصبية في نسبة 1: 1 لإنتاج عامل التغذية العصبية monobiotinylated مونومر. البيروكسيديز، تنضج عامل التغذية العصبية مع الكتلة الجزيئية ل~ 18 كيلو دالتون تم استردادها وتنقيته من وسائل الإعلام باستخدام ني الراتنج (الشكل 1C). كان biotinylation من عامل التغذية العصبية كاملة، كما دلل على ذلك عدم القدرة على كشف معدلة عامل التغذية العصبية التي immunoblotting (الشكل 1D). Streptavidin مترافق نقاط الكم، QD 655، واستخدمت لتسمية mBtBDNF لجعل QD-عامل التغذية العصبية. لم بحضور AviTag لا تتداخل مع نشاط عامل التغذية العصبية كما كان mBtBDNF قادرة على تفعيل TrkB فسفرته (الشكل 1E) وتحفيز ثمرة neurite (الشكل 1F) إلى الحد من عامل التغذية العصبية الدماغي البشري المؤتلف (rhBDNF). المناعية أظهرت أن عامل التغذية العصبية QD-colocalized مع TrkB محاور في قرن آمون، مشيرا إلى أن QD-عامل التغذية العصبية غير النشطة بيولوجيا (الشكل 1G). لدراسة نقل عامل التغذية العصبية، وأضيف إلى عامل التغذية العصبية QD-البعيدة مقصورة محوارالثقافات ميكروفلويديك تحتوي على الفئران E18 الخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 2A). تم القبض QD-عامل التغذية العصبية النقل إلى الوراء في الوقت الحقيقي من محاور التصوير الحي من العلامة الحمراء الفلورسنت (دعم الفيديو S1، S2). من خلال تحليل مخطاط التموج ولدت، لوحظ QD-عامل التغذية العصبية ليتم نقلها retrogradely في سرعة التحرك نحو 1.06 ميكرون / ثانية (الشكل 3A). وقد استخدمت أو GFP mCherry الموسومة عامل التغذية العصبية لتتبع حركة محور عصبي من عامل التغذية العصبية. العوائق الرئيسية هي أنها ليست مشرقة بما فيه الكفاية للدراسات جزيء واحد. أيضا، فإن وجود كل من تقدمي والحركات عامل التغذية العصبية الوراء يجعل من الصعب تقييم ما إذا كان أو لم نقل retrogradely عامل التغذية العصبية في مجمع neurotrophin / مستقبلات.
في هذا الفيديو، ونحن لشرح التقنيات المستخدمة لدراسة الاتجار المباشر لQD-عامل التغذية العصبية في غرف ميكروفلويديك باستخدام الخلايا العصبية الأولية. وultrabrightness وصمود ممتازة من نقاط الكم ماكوفاق من الممكن تتبع أداء طويل الأجل لنقل عامل التغذية العصبية. هذه التقنيات يمكن استغلالها لتعزيز الدراسات وظيفة محور عصبي في AD، HD، والاضطرابات العصبية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن التقرير تطور تقنية جديدة لإنتاج نشطة بيولوجيا، monobiotinylated عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF) التي يمكن استخدامها لتتبع نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية. بواسطة التصريف البروتين إلى نقطة الكم streptavidin، واستخدام غرفة ميكروفلويديك، الأسلوب يسمح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر يو (بولين) هو جين تاو، راشيل Sinit للحصول على المساعدة الفنية. وتدعم الدراسة التي منحة المعاهد الوطنية للصحة (PN2 EY016525) وبتمويل من متلازمة داون مؤسسة البحوث والعلاج ومؤسسة لاري L. Hillblom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 |
| BamHI | Fermentas | FD0054 |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV |
| d-biotin | Sigma | B4639 |
| TurboFect | Fermentas | R0531 |
| PMSF | Sigma | P7626 |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 |
| protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 |
| silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 |
| human recombinant BDNF | Genentech | |
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 |
| 24×40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 |
| poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 |
| HBSS | Gibco | 14185-052 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 |
| B27 | Gibco | 17504-044 |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 |
| trichloroacetic acid | Sigma | T6399 |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | |
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington’s disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
