הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי
Summary
תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.
Abstract
BDNF ממלא תפקיד חשוב בכמה היבטים של הישרדות, בידול, ותפקוד עצביים. גירעונות מבניים ותפקודיים באקסונים נתפסים יותר ויותר כתכונה מוקדמת של מחלות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת הנטינגטון (HD). עדיין לא ברור הוא המנגנון (ים) שבו פציעת axonal מושרה. אנחנו דיווחו על ההתפתחות של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. BDNF שכותרתו נקודה קוונטית (QD-BDNF) הופק על ידי והטה נקודה קוונטית 655 לmBtBDNF. מכשיר microfluidic שימש לבודד את האקסונים מגופי תא נוירון. תוספת של QD-BDNF לתא axonal אפשרה הדמיה חיה של תחבורת BDNF באקסונים. אנחנו הוכיחו כי QD-BDNF עבר בעצם באופן בלעדי retrogradely, עם מעט מאוד הפסקות, במהירות הנעה של כ 1.06 מיקרומטר / sec. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור אותיchanisms של פונקציה שיבשו axonal בספירה או HD, כמו גם הפרעות ניווניות אחרות.
Introduction
נוירונים מקוטבים מאוד תאי תהליכים שארוכים, ולעתים קרובות הרחיב מאוד הם יסוד להקמה ולשמירה על המבנה והתפקוד של מעגלים עצביים. האקסון ממלא תפקיד חיוני בביצוע מטענים אל ומסינפסות. חלבונים ואברונים מסונתזים בסומה התא צריכים להיות מועברים דרך האקסונים להגיע מסוף presynaptic לתמוך תפקוד עצבי. במקביל, אותות המתקבלים באקסונים דיסטלי צריכים להיות transduced והועברו לסומה. תהליכים אלה הם חיוניים להישרדות עצבית, בידול, ותחזוקה. שבהובלת axonal בכמה נוירונים חייבת להתנהל דרך מרחקים יותר מ -1,000 פעמים הקוטר של גוף התא, את האפשרות שנחזתה בקלות שגם גירעונות קטנים יכולים במידה ניכרת להשפיע תפקוד עצבי ומעגל.
המופק ממוח גורם neurotrophic (BDNF), חבר של משפחת neurotrophin של גורמי גדילה, הוא בהווה בmaאזורי ניו יורק במוח, כולל ההיפוקמפוס, קליפת מוח, ומוח קדמי בסיסי. BDNF ממלא תפקיד מכריע בהיווצרות הכרה וזיכרון על ידי תמיכה בהישרדות, בידול, והתפקוד של תאי עצב המשתתפים במעגלים קוגניטיביים. BDNF נקשר לקולטן שלו, TrkB טירוזין קינאז, במסוף האקסון שבו מפעיל מסלולי איתות בתיווך TrkB כוללים חלבון קינאז מופעל mitogen / קינאז תאי מוסדר אות החלבון (MAPK / Erk), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) ופוספוליפאז C-gamma (PLCγ). החלבונים המשתתפים במסלולי איתות אלה ארוזים על גבי מבני לפוחי endocytic כדי ליצור את BDNF / TrkB איתות endosome 1-6 שלאחר מכן הובל retrogradely לסומה העצבית.
חדר תרבות microfluidic הוא פלטפורמה מאוד שימושית לחקר הביולוגיה axonal בתנאים רגילים, כמו גם בהגדרה של 7,8 פציעה והמחלה. על ידי אקסונים בידודמהגופים התא, המכשיר אפשר אחד ללמוד תחבורה במיוחד באקסונים 8-10. פלטפורמות microfluidic מבוססות PDMS עם 450 מיקרומטר מחסומי microgroove שימשו במחקר זה נרכשו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון תחבורת BDNF, שפיתחנו טכנולוגיה חדשנית לייצור BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). אנחנו ניצלנו את הפפטיד acceptor ביוטין, AP (הידוע גם בAviTag). זה רצף חומצות אמינו המכיל 15 שאריות ליזין שניתן ligated במיוחד כדי ביוטין על ידי האנזים Escherichia coli ביוטין האנזים, בירה. אנחנו התמזגו AviTag לC-הסופי של העכבר מראש proBDNF cDNA על ידי PCR (איור 1 א). המבנה שובט לתוך וקטור הביטוי של יונקים, myc-וקטור pcDNA3.1. אנחנו גם משובטים DNA בירה החיידקים לתוך myc-וקטור pcDNA3.1. שני פלסמידים היו זמניים במשותף transfected לתאי HEK293FT לבטא שני החלבונים. בירה הייתה זרז לקשירה של ביובאופן ספציפי ליזין מתגורר בתוך AviTag בC-הסופי של BDNF ב1: 1 יחס לתוצרת monobiotinylated מונומר BDNF. Biotinylated, להתבגר BDNF עם מסה מולקולרית של ~ 18 kDa היה התאושש ומטוהר מהתקשורת באמצעות Ni-שרף (איור 1 ג). Biotinylation של BDNF היה מלא, כמו להישפט על ידי חוסר היכולת לזהות BDNF ללא שינוי על ידי immunoblotting (1D איור). נקודות streptavidin מצומדות קוונטים, QD 655, שמשו לתייג mBtBDNF לעשות QD-BDNF. הנוכחות של AviTag לא להפריע לפעילות של BDNF כmBtBDNF הייתה מסוגלת להפעיל TrkB פוספורילציה (איור 1E) ולעורר תולדת neurite (איור 1F) בהיקף של BDNF רקומביננטי האנושי (rhBDNF). Immunostaining הראה כי QD-BDNF colocalized עם TrkB באקסונים בהיפוקמפוס, המצביע על כך QD-BDNF הוא ביו (איור 1G). ללמוד תחבורת BDNF, QD-BDNF התווסף לתא האקסון הדיסטלי שלתרבויות microfluidic מכילות חולדה נוירונים בהיפוקמפוס (איור 2 א) E18. תחבורה מדרדר QD-BDNF בתוך האקסונים נתפסה על ידי הדמיה חיה בזמן אמת של תג הניאון האדום (S1 תמיכת קטעי וידאו, S2). על ידי ניתוח רשם גלים שנוצרו, QD-BDNF נצפה להיות מועבר retrogradely במהירות מרגשת של כ 1.06 מיקרומטר / sec (איור 3 א). GFP או BDNF מתויג mCherry היה בשימוש כדי לעקוב אחר תנועת axonal של BDNF. החסרונות העיקריים הם שהם לא בהירים מספיק ללימודי מולקולה בודדים. כמו כן, הנוכחות של שני אנטרוגדית ותנועות BDNF המדרדר עושה את זה קשה להעריך האם או לא BDNF מועבר retrogradely היה במתחם neurotrophin / קולט.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי. Ultrabrightness וphotostability מצוין של Mak נקודות קוונטיותes זה ניתן לבצע מעקב ארוך טווח של תחבורת BDNF. ניתן לנצל את הטכניקות הללו כדי לשפר את הלימודים של פונקצית axonal בספירה, HD, והפרעות ניווניות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מדווחים על הפיתוח של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. על ידי להטות את החלבון לstreptavidin נקודה קוונטית, ובאמצעות תא microfluidic, השיטה מאפשרת לאדם לזהות תחבורת axonal של BDNF בנוירונים עיקרי עם רגישות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליואה (פאולין) הו, רחל Sinit לקבלת הסיוע הטכני שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק NIH (EY016525 PN2) ועל ידי מימון מחקר תסמונת דאון וטיפול הקרן ולארי L. Hillblom הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 |
| BamHI | Fermentas | FD0054 |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV |
| d-biotin | Sigma | B4639 |
| TurboFect | Fermentas | R0531 |
| PMSF | Sigma | P7626 |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 |
| protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 |
| silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 |
| human recombinant BDNF | Genentech | |
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 |
| 24×40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 |
| poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 |
| HBSS | Gibco | 14185-052 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 |
| B27 | Gibco | 17504-044 |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 |
| trichloroacetic acid | Sigma | T6399 |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | |
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington’s disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
